急性DSS结肠炎模型建立与益生菌干预
比较三联BLE与四联BLEB的抗结肠炎效果并确定更优配方。
ICR小鼠随机分为Con、DSS、BLE、BLEB-L、BLEB-H五组，DSS组及干预组给予2.5% DSS饮水，同时每日灌胃生理盐水、BLE或BLEB，连续7天。
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补充蜡样芽孢杆菌增强三联益生菌的抗结肠炎效果：四联益生菌保护中肠道菌群-亚精胺相关轴的相关性证据
Supplementation of Bacillus cereus Enhances Anti-Colitis Effects of Triple Probiotics in Mice: Correlative Evidence for a Gut Microbiota-Spermidine-Related Axis in Quadruple-Probiotic Protection
实验完整度
高含DSS小鼠模型、Caco-2细胞模型、16S rRNA测序、代谢组学、转录组学及Treg/Th17等功能验证
主要模型
急性DSS诱导的ICR小鼠结肠炎模型 DSS损伤的Caco-2结肠上皮细胞模型
重点核对
DSS浓度2.5%（w/v）饮水，建模与灌胃干预同时进行7天 BLE及BLEB-L灌胃剂量0.92 g/kg/天，BLEB-H为2.77 g/kg/天，灌胃体积0.25 mL，每日一次 粪便样本于干预第4天和第8天收集用于16S rRNA测序 Caco-2细胞以3% DSS处理24 h，亚精胺组为200 μM亚精胺与3% DSS共处理 表型检测每组n=7（结肠长度、16S），部分指标n=6或n=3，详见各图注
摘要
背景：溃疡性结肠炎（UC）是一种与肠道菌群失调相关的慢性复发性炎症性肠病。三联益生菌混合物BLE（婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌）含有高度氧敏感的菌株，在胃肠道转运过程中容易失去活力。添加兼性需氧的蜡样芽孢杆菌形成四株益生菌配方BLEB。本研究旨在确定添加蜡样芽孢杆菌是否改善BLE的抗结肠炎能力，并探索潜在的菌群-亚精胺相关调控机制。方法：应用急性葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型比较BLE和BLEB的治疗效果。我们评估了疾病表型、肠上皮屏障完整性和脾脏Treg/Th17免疫稳态。动态16S rRNA测序和非靶向肠道代谢组学表征了肠道微生物和代谢改变，并用Spearman相关进行菌群-代谢物关联分析。对DSS损伤的Caco-2细胞进行转录组分析以检查对亚精胺的分子反应。结果：与BLE相比，BLEB表现出更优的剂量依赖性抗结肠炎效果。BLEB富集有益乳杆菌科并恢复包括亚精胺在内的肠腔多胺代谢物。Spearman相关揭示乳杆菌科相关属与多胺水平之间显著正相关。体外，亚精胺逆转DSS引起的转录扰动并上调Caco-2细胞中以谷胱甘肽为中心的抗氧化相关基因的转录。结论：蜡样芽孢杆菌引入的生态协同可能重塑肠道菌群并增加菌群相关亚精胺，部分促成BLEB增强的黏膜保护。这项工作为开发需氧-厌氧联合益生菌鸡尾酒用于辅助UC治疗提供了临床前证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 添加兼性需氧蜡样芽孢杆菌能否增强三联益生菌BLE的抗结肠炎能力，以及菌群-亚精胺相关轴是否参与其保护机制。
- 核心机制
- 蜡样芽孢杆菌可能通过清除肠道游离氧、创造厌氧生态位，促进氧敏感益生菌存活与定植，重塑肠道菌群并提高肠腔亚精胺水平，从而部分增强黏膜保护；亚精胺可能通过增强以谷胱甘肽为中心的抗氧化转录反应减轻上皮损伤。
- 主要证据
- 在急性DSS结肠炎小鼠中，BLEB剂量依赖性地改善疾病表型、修复紧密连接和黏蛋白表达、抑制促炎因子并恢复Treg/Th17平衡；16S rRNA测序和代谢组学显示BLEB富集乳杆菌科并恢复亚精胺等多胺，Spearman相关显示乳杆菌科相关属与多胺正相关；DSS损伤Caco-2细胞的RNA-seq显示亚精胺逆转转录扰动并上调谷胱甘肽代谢相关基因。
- 研究意义
- 为含需氧菌的复合益生菌配方辅助UC治疗提供了剂量依赖性体内证据和菌群-亚精胺代谢机制的相关性线索，并为合理优化IBD干预的益生菌组合提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
疾病表型与组织病理学评估
评估益生菌对结肠炎宏观和微观病理的改善作用。
每日记录体重和DAI，第8天处死测量结肠长度，H&E染色观察黏膜结构并进行盲法病理评分，ELISA检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS。
脾脏Treg/Th17免疫稳态检测
评估BLEB对全身免疫失衡的调节作用。
制备脾脏单细胞悬液，PMA/离子霉素/布雷菲德菌素A刺激后，表面染CD4，胞内染IL-17A，核内染Foxp3，流式检测CD4+Foxp3+ Treg和CD4+IL-17A+ Th17比例并计算比值。
肠上皮屏障相关基因和蛋白表达检测
验证BLEB对紧密连接和黏蛋白表达的修复作用。
qRT-PCR检测结肠组织E-cadherin、Occludin、MUC-2、Claudin-1 mRNA表达，Western blot检测对应蛋白表达。
动态16S rRNA测序分析肠道菌群
表征BLEB对肠道菌群组成和多样性的动态重塑。
于干预第4天和第8天收集新鲜粪便，提取DNA，扩增16S rRNA V3-V4区，Illumina NovaSeq 6000测序，分析α多样性、PCA β多样性和属/种水平差异丰度。
非靶向LC-MS代谢组学及菌群-代谢物关联分析
筛选BLEB调控的核心保护性代谢物并分析其与菌群的相关性。
对结肠内容物进行非靶向LC-MS代谢组学检测，鉴定差异代谢物，KEGG通路富集，并用Spearman相关分析差异菌群与亚精胺等多胺的关联。
DSS损伤Caco-2细胞的转录组分析
探索亚精胺对肠上皮细胞损伤的分子转录反应。
Caco-2细胞设Con、DSS损伤（3% DSS 24 h）、亚精胺干预（200 μM亚精胺+3% DSS）三组，提取RNA构建链特异性文库，Illumina NovaSeq测序，DESeq2筛选DEGs并进行KEGG富集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 益生菌制剂 | 三联益生菌混合物 | Hangzhou Yuanda Biopharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 四联益生菌混合物 | Hangzhou Yuanda Biopharmaceutical Co., Ltd. | -- | |
| 结肠炎建模 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
| Western blot | 抗Occludin抗体 | Proteintech | 27260-1-AP |
| 抗Claudin-1抗体 | Proteintech | 13050-1 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗MUC-2抗体 | Yamei Biopharmaceutical Technology Co., Ltd. | R014045 | |
| 抗E-cadherin抗体 | HUABIO | EM0502 | |
| HRP标记二抗 | ABclonal | AS014 | |
| HRP标记二抗 | ABclonal | AS003 | |
| 流式分析 | FITC标记抗CD4抗体 | BioLegend | -- |
| APC标记抗IL-17A抗体 | BioLegend | -- | |
| PE标记抗CD3抗体 | BioLegend | -- | |
| APC标记抗Foxp3抗体 | BioLegend | -- | |
| 细胞处理 | 亚精胺标准品 | Sigma-Aldrich | -- |
| 粪便DNA提取 | 粪便DNA提取试剂盒 | Omega Bio-tek, Inc. | -- |
| 16S rRNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina, Inc. | -- |
| LC-MS代谢组学 | Vanquish Flex超高效液相色谱仪 | -- | -- |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | -- | -- | |
| Acquity UPLC HSS T3色谱柱 | Waters Corporation | -- | |
| RNA-seq | Illumina NovaSeq测序平台 | Illumina | -- |
| 血清检测 | 酶联免疫吸附测定试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与分组 | 小鼠品系、周龄、体重、来源、饲养条件、随机分组及每组样本量；DSS浓度2.5%、给药途径与持续时间；益生菌剂量0.92 g/kg和2.77 g/kg、灌胃体积0.25 mL、每日一次连续7天。 阅读提示：Materials and Methods 2.2 Animals and Ethical Approval、2.3 Model Establishment and Drug Intervention；Figure 1 legend |
| 表型与组织病理评估 | 体重记录频率、DAI评分标准、处死时间点、结肠长度测量方法、H&E染色步骤和盲法病理评分；各指标样本量（结肠长度n=7、ELISA n=6、病理n=3）。 阅读提示：Materials and Methods 2.4、2.5、2.6；Figure 1 legend |
| 免疫细胞流式分析 | 脾脏单细胞悬液制备、刺激剂PMA/离子霉素/布雷菲德菌素A、表面和胞内/核内染色抗体克隆号（文中未明确说明）、每组n=3。 阅读提示：Materials and Methods 2.9；Figure 1H legend |
| 肠道菌群16S rRNA测序 | 粪便收集时间点（第4天和第8天）、DNA提取试剂盒、16S V3-V4引物341F/806R、测序平台Illumina NovaSeq 6000、每组n=7、生物信息分析流程。 阅读提示：Materials and Methods 2.10；Figure 3 legend |
| 非靶向代谢组学 | 结肠内容物取样量50 mg、53%甲醇提取、色谱柱和流动相条件、质谱扫描范围m/z 50–1200、正负ESI模式、QC样本和空白设置、每组n=6、仅分析Con/DSS/BLEB-L/BLEB-H组。 阅读提示：Materials and Methods 2.11；Figure 4 legend |
| Caco-2转录组实验 | Caco-2细胞培养条件（DMEM+20% FBS，37 °C、5% CO2）、3% DSS处理24 h、200 μM亚精胺共处理、每组n=3、RNA-seq平台和DESeq2分析参数（|log2FC| ≥ 1，校正p < 0.01）。 阅读提示：Materials and Methods 2.12；Figure 5 legend |
| 统计分析 | 数据以mean ± SEM表示；纵向数据用双因素重复测量ANOVA加Tukey事后检验；终点指标用单因素ANOVA加Tukey多重比较；Spearman相关分析；显著性阈值p < 0.05。 阅读提示：Materials and Methods 2.13 |