放疗抵抗细胞模型建立与CRISPR筛选
建立获得性放疗抵抗模型并筛选分次照射下维持细胞适应性的基因。
逐步照射建立SW480-R和HCT116-R；在SW480-Cas9中进行TKOv3全基因组CRISPR–Cas9功能缺失筛选，分次2 Gy×4，匹配非照射对照，DrugZ分析。
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CRAT介导的乙酰肉碱穿梭通过维持p65乙酰化支持结直肠癌中NF-κB相关的放疗抵抗
CRAT-mediated acetylcarnitine shuttling sustains p65 acetylation and NF-κB-associated radioresistance in colorectal cancer
实验完整度
高含CRISPR全基因组筛选、转录组/蛋白质组、细胞系、动物模型、患者样本及机制与功能验证
主要模型
SW480及其放疗抵抗衍生SW480-R细胞 HCT116及其放疗抵抗衍生HCT116-R细胞 MC38同基因肿瘤模型 直肠癌患者配对治疗前后组织样本
重点核对
放疗抵抗细胞系建立：逐步照射2、4、6、8、10 Gy各两次至累积60 Gy CRISPR筛选：SW480-Cas9 MOI约0.3，TKOv3文库，分次2 Gy×4，末次后72 h采集 机制实验照射：单次6 Gy（剂量存活0–10 Gy） 动物放疗：8 Gy于第0、2、4天局部照射，每组5只 CA-170处理：5 µM（细胞）或10 mg/kg瘤内注射（动物）
摘要
背景：新辅助放化疗是局部晚期直肠癌的标准治疗，但获得性耐药限制了持久的肿瘤控制。应激适应性乙酰基代谢是否参与这一耐药尚不清楚。方法：我们在分次照射下进行了全基因组CRISPR–Cas9功能缺失筛选，并将结果与逐步照射建立的放疗抵抗结直肠癌模型的转录组和蛋白质组图谱整合。通过遗传扰动、催化失活重建、乙酰化模拟p65拯救、RELA敲低、稳定同位素示踪、游离辅酶A定量、NF-κB报告基因试验、染色质免疫沉淀-qPCR以及异种移植和同基因肿瘤模型研究了CRAT功能。结果：通过CRISPR筛选与放疗抵抗细胞转录组和蛋白质组特征的跨平台汇聚，CRAT被优先考虑，治疗后病理消退较差的肿瘤显示更高的CRAT和核p65免疫组化评分。CRAT操作对基础增殖影响有限且呈模型依赖性，但照射后影响更明显，CRAT缺失降低了克隆存活并伴有氧化应激增加和持续性DNA损伤。稳定同位素示踪显示，照射增加了对照细胞中乙酸到乙酰肉碱的通量并扩大了游离辅酶A池，而CRAT缺失破坏了这种乙酰基缓冲。机制上，CRAT催化活性有助于维持照射诱导的p65 Lys310乙酰化、NF-κB响应位点的H3K27ac富集以及通过p300/CBP敏感性乙酰化轴的NF-κB相关转录输出。p65-K310Q拯救和RELA敲低支持p65乙酰化和RELA依赖转录作为CRAT依赖性辐射保护的下游贡献者而非唯一介质。在同基因MC38肿瘤中，Crat缺失增强了分次放疗的响应。结论：这些发现支持CRAT依赖性乙酰基代谢作为NF-κB相关辐射保护程序的贡献者，并提出这种代谢依赖性作为结直肠癌放疗增敏的候选脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CRAT介导的乙酰基代谢是否以及如何参与结直肠癌放疗抵抗和照射后的应激适应。
- 核心机制
- CRAT催化活性维持照射后乙酰基/游离CoA稳态，支持p300/CBP依赖的p65 Lys310乙酰化和NF-κB响应位点H3K27ac富集，从而促进NF-κB相关转录输出和辐射保护。
- 主要证据
- CRISPR筛选与多组学汇聚优先CRAT；CRAT敲除/过表达影响照射后克隆存活、氧化应激、DNA损伤、NF-κB报告基因和靶基因；CRAT-WT而非H343A恢复CoA、p65乙酰化和H3K27ac；p65-K310Q和RELA敲低支持下游贡献；HCT116-R和MC38模型及患者样本支持体内相关性。
- 研究意义
- 将CRAT依赖性乙酰基代谢与NF-κB相关辐射保护程序联系，提出该代谢依赖性作为结直肠癌放疗增敏的候选脆弱性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多组学整合优先候选基因
通过转录组和蛋白质组与筛选结果汇聚优先关键基因。
对SW480、SW480-R、HCT116、HCT116-R进行RNA-seq和label-free蛋白质组，与CRISPR筛选候选取交集。
CRAT遗传扰动与照射后表型验证
验证CRAT对基础增殖及照射后存活、氧化应激和DNA损伤的影响。
在抵抗细胞中敲除CRAT、在亲本细胞中过表达CRAT；检测CCK-8、EdU、克隆形成、Annexin V/PI、DCFH-DA、MitoSOX、中性彗星、γH2AX和RAD51 foci、细胞周期。
CRAT催化活性与乙酰基/CoA稳态及p65乙酰化机制验证
确定CRAT催化活性是否维持照射后乙酰基缓冲、CoA池和p65 Lys310乙酰化。
稳定同位素示踪、游离CoA测定、CRAT-WT/H343A重建、A-485处理、乙酰-p65 ELISA和免疫印迹、NF-κB报告基因、p65-K310Q拯救和RELA敲低。
染色质乙酰化与NF-κB靶基因验证
验证CRAT依赖的H3K27ac、RELA占据和NF-κB靶基因表达。
ChIP-qPCR检测NFKBIA、TNFAIP3、BIRC3位点H3K27ac和RELA；RT-qPCR检测靶基因表达。
体内遗传与药物验证
评估CRAT缺失/过表达及NF-κB或CRAT药理学抑制对分次放疗响应的影响。
HCT116-R和HCT116异种移植、MC38同基因肿瘤；分次局部放疗；BAY 11-7082腹腔注射和CA-170瘤内注射；检测肿瘤生长、终点重量、H&E、TUNEL、免疫组化。
免疫微环境与临床样本关联分析
描述Crat缺失联合放疗的免疫变化并评估患者样本中CRAT/p65与病理消退的关联。
MC38肿瘤单细胞RNA测序、流式细胞术和RT-qPCR；直肠癌配对治疗前后样本免疫组化，按TRG 0–1与2–3分组比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| CRISPR筛选 | TKOv3文库 | Addgene | 125517 |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 质谱分析 | timsTOF Pro质谱仪 | -- | -- |
| 药物处理 | A-485 | -- | -- |
| BAY 11-7082 | -- | -- | |
| CA-170 | -- | -- | |
| 克隆形成 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 流式分析 | Annexin V-FITC/PI | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA | -- | -- |
| MitoSOX Red | -- | -- | |
| 细胞ELISA | 细胞ELISA试剂盒 | Abbexa | abx596076 |
| RNA提取 | TRIzol | -- | -- |
| RT-qPCR | TB Green化学试剂 | -- | -- |
| ChIP-qPCR | 甲醛 | -- | -- |
| 代谢物分析 | Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪 | -- | -- |
| 游离CoA测定 | 辅酶A检测试剂盒 | Abcam | ab102504 |
| CRAT活性测定 | DTNB | -- | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
| TUNEL染色 | 一步法TUNEL试剂盒 | Beyotime | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 放疗抵抗细胞系建立 | 逐步照射剂量2、4、6、8、10 Gy各两次，累积60 Gy；恢复7–14天或至约80%汇合 阅读提示：Methods 'Cell culture and generation of radioresistant cells'及Fig. 1A图注 |
| CRISPR–Cas9筛选 | MOI约0.3，TKOv3文库，分次2 Gy×4，末次后72 h采集，非照射对照 阅读提示：Methods 'Pooled CRISPR–Cas9 screen'及Fig. 1D图注 |
| 机制实验照射条件 | 单次6 Gy（剂量存活0–10 Gy），6-MV X射线 阅读提示：Methods 'Irradiation and drug treatment' |
| CRAT重建与药物处理 | CRAT-WT/H343A表达；A-485 1 µM照射前2 h；CA-170浓度0.01–100 µM（细胞5 µM） 阅读提示：Methods 'CRAT knockout, reconstitution, and overexpression'及'Irradiation and drug treatment' |
| 动物放疗与给药 | 8 Gy于第0、2、4天局部照射；每组5只；BAY 11-7082 5 mg/kg腹腔注射；CA-170 10 mg/kg瘤内注射 阅读提示：Methods 'Animal studies'及Fig. 7图注 |