鉴定淋巴细胞特异性超级增强子
确定ETV6-SE是否在ALL中广泛存在并具有调控意义。
分析GEO/ENCODE中178个正常和恶性人类细胞系的SE景观，用ROSE算法定义SE，筛选LSE，并进行基因组注释、motif分析和ATAC-seq验证。
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ETV6重排通过破坏急性淋巴细胞白血病中的基因内超级增强子抑制CDKN1B转录
ETV6 Rearrangement Suppresses CDKN1B Transcription by Disrupting an Intragenic Super-enhancer in Acute Lymphoblastic Leukemia
实验完整度
高包含患者样本组学分析、多种细胞系体外功能验证、CRISPRi/KO机制验证及PDX体内药效验证。
主要模型
ALL患者骨髓样本 Nalm6、Jurkat、697细胞系 患者来源异种移植（PDX）模型
重点核对
ETV6-SE与CDKN1B的长距离染色质相互作用（Hi-C/4C-seq） E3核心增强子调控CDKN1B的CRISPRi和CRISPR/Cas9敲除验证 CDKN1B敲低后NF-κB通路激活及BCL-2/BCL-XL表达变化 PDX模型中navitoclax或venetoclax联合地塞米松的叠加效应
摘要
ETV6重排的急性淋巴细胞白血病（ALL）在成人中与不良预后相关。此前，在一种罕见的融合基因ETV6::ACSL6中发现了位于ETV6基因内区域的超级增强子（ETV6-SE）；然而，尚需进一步研究以确定ETV6-SE是否广泛存在于ALL中，以及ETV6重排如何影响该SE的功能。在本研究中，我们证明ETV6通过ETV6-SE在ALL中发挥调控元件的作用，CDKN1B是其关键靶点。CRISPR干扰和敲除实验揭示了ETV6-SE内负责调控CDKN1B的核心增强子区域。ETV6重排破坏了ETV6-SE，并损害了其与CDKN1B位点的长距离染色质相互作用，导致CDKN1B下调，进而激活NF-κB通路并增加抗凋亡蛋白BCL-2/BCL-XL的表达。在患者来源的异种移植模型中，使用venetoclax或navitoclax对BCL-2/BCL-XL进行药理学抑制，与地塞米松联合时显示出叠加效应。总之，这些发现确立了ETV6-SE–CDKN1B调控轴作为导致ETV6重排ALL治疗耐药的一种机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ETV6-SE是否广泛存在于ALL中，以及ETV6重排如何影响其功能并导致治疗耐药。
- 核心机制
- ETV6重排破坏ETV6-SE，损害其与CDKN1B的长距离染色质相互作用，导致CDKN1B下调，进而激活NF-κB通路并上调抗凋亡蛋白BCL-2/BCL-XL。
- 主要证据
- 通过CRISPRi和敲除实验鉴定E3核心增强子；Hi-C/4C-seq显示ETV6-SE与CDKN1B相互作用减弱；CDKN1B敲低激活NF-κB并上调BCL-XL；PDX模型中navitoclax联合地塞米松显示叠加效应。
- 研究意义
- 确立了ETV6-SE–CDKN1B调控轴作为ETV6重排ALL治疗耐药的一种机制，提示BCL-2/BCL-XL抑制剂值得进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析ETV6重排的基因组特征
明确ALL中ETV6重排的断点分布及其对SE结构的影响。
对50例ALL患者进行WGS，按ETV6状态分层，分析SNV和结构变异；用CUT&Tag检测组蛋白修饰。
发现CDKN1B在ETV6重排ALL中下调
探究ETV6-SE截断对邻近基因转录的影响。
对83例ALL患者RNA-seq进行UMAP和差异表达分析，检测ETV6±1 Mb内10个基因表达，并用CUT&Tag分析CDKN1B/APOLD1位点组蛋白修饰。
验证ETV6-SE与CDKN1B的长距离调控
确定ETV6-SE是否通过长距离染色质相互作用调控CDKN1B。
分析公共HiChIP和Hi-C数据，对Non_ER患者进行Hi-C和4C-seq，用BRD4抑制剂处理细胞后检测相互作用和CDKN1B表达。
鉴定ETV6-SE内核心增强子E3
确定ETV6-SE中调控CDKN1B的关键增强子元件。
用CRISPRi靶向候选增强子E1、E2、E3，并用CRISPR/Cas9敲除E3，检测ETV6和CDKN1B表达及染色质相互作用。
验证CDKN1B敲低对NF-κB和抗凋亡信号的影响
探究CDKN1B在ALL细胞中的功能及其与NF-κB通路的关联。
建立CDKN1B敲低细胞系，进行RNA-seq、RT-qPCR和Western blot，检测NF-κB通路和BCL-2家族表达；用免疫共沉淀-质谱分析CDKN1B相互作用组。
评估BCL-2/BCL-XL抑制剂的体外和体内效果
测试venetoclax或navitoclax联合地塞米松在ETV6-SE破坏模型中的效果。
在细胞系和PDX细胞中进行细胞毒性实验和凋亡分析；在PDX小鼠模型中评估navitoclax联合地塞米松的疗效。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 骨髓单个核细胞分离 | Ficoll分离液 | Serumwerk Bernburg AG | 1858 |
| RT-qPCR | Evo M-MLV逆转录预混液 | Accurate Biology | AG11706 |
| SYBR Green Pro Taq HS | Accurate Biology | AG11701 | |
| CRISPR/dCas9 | pHR-SFFV-KRAB-dCas9-P2A-mCherry质粒 | Addgene | 60954 |
| sgRNA克隆 | BamHI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0136T |
| EcoRI限制性内切酶 | New England Biolabs | R3101T | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Vazyme | DL101 |
| CUT&Tag | H3K27ac抗体 | Cell Signaling Technology | 8173 |
| H3K4me1抗体 | Active Motif | 39635 | |
| H3K4me3抗体 | Abcam | ab8580 | |
| H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733 | |
| Hi-C | MboI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0147M |
| 4C-seq | DpnII限制性内切酶 | New England Biolabs | R0543S |
| T4 DNA连接酶 | New England Biolabs | M0202S | |
| 链霉亲和素 | Thermo Fisher Scientific | 11206D | |
| 细胞培养 | AIM V培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31035025 |
| 支原体检测 | MycoBlue支原体检测试剂盒 | Vazyme | D101-01 |
| 流式细胞术 | 人/鼠CD45抗体 | BD Biosciences | 563204; 553079 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Yeasen Biotechnology | 20115ES60 |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Amersham | 10600023 | |
| ETV6抗体 | ABclonal | A1637 | |
| CDKN1B抗体 | ABclonal | A19095 | |
| 磷酸化p65抗体 | ABclonal | AP1294 | |
| p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| BCL-2抗体 | ABclonal | A19693 | |
| BCL-XL抗体 | ABclonal | A23766 | |
| Bim抗体 | ABclonal | A19702 | |
| DUSP16抗体 | ABclonal | A10155 | |
| STYK1抗体 | Absin Bioscience | abs111324 | |
| GAPDH抗体 | ABclonal | AC001 | |
| 细胞毒性实验 | 地塞米松 | Selleck Chemicals | S1322 |
| Venetoclax | Selleck Chemicals | S8048 | |
| Navitoclax | Selleck Chemicals | S1001 | |
| CCK-8试剂 | Meilunbio | MA0225 | |
| 细胞凋亡分析 | Annexin V/FITC试剂盒 | Meilunbio | MA0220 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本分组与测序 | 患者分组（ETV6_wt、Non_ER、ER）、样本量（WGS 50例，RNA-seq 83例）、测序平台和数据分析参数 阅读提示：Methods中“Whole-genome sequencing and analysis”和“RNA sequencing and analysis”小节；Results中“Genomic characteristics of ETV6 alterations in ALL”和“CDKN1B is dysregulated in ETV6-rearranged ALL”段落 |
| CRISPRi和CRISPR/Cas9敲除 | sgRNA序列（见Supplementary Table S3）、细胞系（Jurkat、697、Nalm6）、电转参数（1300 V，20 ms）、克隆筛选方法 阅读提示：Methods中“CRISPR/dCas9”和“Generation of cells with CRISPR/Cas9-induced loss of ETV6-SE”小节；Supplementary Table S3 |
| Hi-C和4C-seq | 细胞数量（Hi-C 1000万，4C-seq 500万）、限制性内切酶（MboI、DpnII）、交联条件、文库构建和测序深度 阅读提示：Methods中“Hi-C sequencing”和“4C sequencing and analyses”小节；Figure 4图注 |
| PDX模型与药物处理 | 小鼠品系（NOD/SCID gamma）、细胞接种量（300万）、分组（vehicle、dex、navitoclax、联合组）、给药剂量和途径（文中未明确说明具体剂量）、每组样本量（n=4-5） 阅读提示：Methods中“PDX generation”和“Cytotoxicity assays”小节；Figure 7图注；Supplementary Fig. S10 |
| 细胞毒性实验 | 细胞接种密度（PDX细胞30000/孔，细胞系20000/孔）、药物浓度范围、孵育时间、CCK-8检测时间 阅读提示：Methods中“Cytotoxicity assays”小节；Figure 6H和7E图注 |