FOXP3过表达及RNA-seq机制筛选
探究心肌细胞FOXP3抗肥大的分子基础。
在H9c2细胞中过表达FOXP3，经ISO处理后有参比组进行RNA-seq，分析差异基因和KEGG通路，并验证FTH1表达及铁死亡指标。
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心肌细胞FOXP3及细胞外囊泡介导的FOXP3递送在治疗病理性心脏肥大中的作用
The role of cardiomyocytic FOXP3 and extracellular vesicle-mediated delivery of FOXP3 into cardiomyocytes for treating pathological cardiac hypertrophy
实验完整度
高含H9c2、NRVMs体外模型、ISO小鼠模型、RNA-seq、EV示踪及功能机制验证
主要模型
H9c2(2-1)大鼠心肌细胞系 新生大鼠原代心室肌细胞（NRVMs） ISO诱导的小鼠心脏肥大模型 Jurkat Clone E6-1 T细胞系
重点核对
H9c2和NRVMs中ISO处理浓度5 μg/L、24 h，cEVs/jEVs处理浓度50 μg/mL ISO小鼠模型给药10 mg/kg（s.c.，q.d.，14天）或10 mg/kg（b.i.d.，s.c.，3天） cEVs体内给药10 mg/kg单次i.v.；FOXP3-jEVs与Veh-jEVs给药5 mg/kg每三天i.v. GW4869处理1 mg/kg i.p. q.d.，用于抑制EV产生 NRVMs中FOXP3-jEVs与Veh-jEVs对比剂量为25 μg/mL
摘要
虽然叉头螺旋转录因子P3（FOXP3）是T细胞中的关键调节因子，但我们此前报道了其在心肌细胞中的抗肥大作用。在本研究中，通过过表达FOXP3并使用RNA-seq，我们发现FOXP3通过上调铁蛋白重链1从而抑制铁死亡来抑制病理性心脏肥大。然而，单细胞RNA测序数据库数据显示，体内心肌细胞中Foxp3 mRNA极少，尽管存在FOXP3蛋白。在此，我们鉴定出携带FOXP3蛋白的心脏微环境来源细胞外囊泡（cEVs）是心肌细胞FOXP3的来源。利用这种细胞间递送机制，我们证明给予来自健康心脏的FOXP3+ cEVs可减轻异丙肾上腺素（ISO）诱导的铁死亡和肥大。由于大规模生产cEVs不切实际，我们鉴定出Jurkat细胞作为FOXP3+ EVs的替代来源。Jurkat细胞来源的EVs（jEVs）增加了心肌细胞FOXP3的含量，从而逆转肥大反应。此外，我们工程化改造Jurkat细胞以增加jEVs中的FOXP3含量，从而获得富含FOXP3的jEVs，与天然EVs相比，其表现出更优越的肥大减轻和铁死亡抑制作用。这些发现表明，通过工程化的富含FOXP3的细胞外囊泡增加心肌细胞中FOXP3蛋白的含量，为治疗心脏肥大提供了一种新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 心肌细胞FOXP3是否通过调控铁代谢抑制铁死亡来缓解病理性心脏肥大，以及能否通过细胞外囊泡递送FOXP3蛋白治疗心脏肥大。
- 核心机制
- FOXP3通过上调铁蛋白重链1（FTH1）促进Fe2+转化为Fe3+储存，恢复铁稳态并抑制铁死亡，从而减轻病理性心脏肥大；心肌细胞FOXP3主要来源于心脏微环境细胞外囊泡的递送。
- 主要证据
- H9c2过表达FOXP3的RNA-seq显示铁死亡通路及Fth1改变；cEVs和jEVs在H9c2与NRVMs中增加FOXP3、上调FTH1、降低Fe2+和脂质ROS、减轻肥大；ISO小鼠中cEVs和FOXP3-jEVs改善心功能、减轻纤维化和细胞面积、抑制铁死亡。
- 研究意义
- 通过工程化富含FOXP3的细胞外囊泡增加心肌细胞FOXP3含量，为治疗病理性心脏肥大提供了一种新的纳米干预策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
心肌细胞FOXP3来源鉴定
确定体内心肌细胞FOXP3蛋白是否来源于心脏微环境EVs。
利用HPA单细胞数据库分析Foxp3 mRNA表达，免疫荧光比较FOXP3蛋白，GW4869抑制EV产生，分离cEVs并进行TEM、NTA和Western blot表征，PKH67示踪cEVs被H9c2摄取。
cEVs体内治疗评价
验证健康心脏来源cEVs对ISO诱导小鼠心脏肥大的治疗作用。
建立短期ISO肥大模型，静脉注射cEVs，进行DiR活体成像、超声心动图、血清LDH1/CK-MB/ANP/BNP检测、组织染色及心脏FTH1/GPX4/Fe2+检测。
cEVs体外抗肥大及抗铁死亡验证
在心肌细胞层面验证cEVs增加FOXP3并抑制肥大和铁死亡。
ISO诱导H9c2和NRVMs肥大，给予健康小鼠来源cEVs，检测细胞面积、肥大基因、FOXP3、FTH1、Fe2+和脂质ROS。
Jurkat来源jEVs替代cEVs验证
筛选FOXP3+ EVs的替代细胞来源并验证其功能。
培养Jurkat、Raw 264.7和NRCF并提取EVs，Western blot检测FOXP3；在H9c2和NRVMs中验证jEVs增加FOXP3、抗肥大及抑制铁死亡。
工程化FOXP3富集jEVs构建及体外验证
通过过表达FOXP3提高jEVs中FOXP3含量并比较抗肥大效果。
用携带FOXP3的慢病毒感染Jurkat细胞，嘌呤霉素筛选，提取FOXP3-jEVs和Veh-jEVs，表征EVs并在NRVMs中比较FOXP3含量、细胞面积、肥大基因、FTH1、Fe2+和脂质ROS。
FOXP3-jEVs体内治疗效果评价
在长期ISO肥大模型中验证FOXP3-jEVs的疗效和安全性。
建立14天ISO肥大模型，每三天静脉注射Veh-jEVs或FOXP3-jEVs，进行DiR成像、超声心动图、血清指标、组织染色、心脏FTH1/GPX4/Fe2+/MDA检测及安全性评估。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抑制EV产生 | GW4869 | MCE | HY-19363 |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Dowobio Biotechnology | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Beyotime | -- | |
| 原代心肌细胞分离 | 胰蛋白酶 | Beyotime | -- |
| 心脏组织消化 | II型胶原酶 | -- | -- |
| EV分离 | Optima XPN-100超速离心机 | Beckman Coulter | -- |
| EV表征 | HT78800透射电子显微镜 | HITACHI | -- |
| Zetasizer Nano ZS纳米粒度分析仪 | Malvern | -- | |
| 慢病毒感染 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 慢病毒感染筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| EV示踪 | PKH67荧光染料 | Umibio | -- |
| 免疫荧光 | Actin Tracker-555 | Beyotime | -- |
| 抗FOXP3抗体 | Santa Cruz | sc-166212 X | |
| AF488标记二抗 | Invitrogen | AB_2633282 | |
| DAPI | Servicebio | -- | |
| 超声心动图 | 异氟烷 | -- | -- |
| 小动物超声成像系统VEVO3100 IT | Fujifilm VisualSonics | -- | |
| 组织切片 | HistoCore BIOCUT切片机 | Laica | -- |
| 免疫组化 | 抗FTH1抗体 | Abcam | ab75972 |
| 抗GPX4抗体 | Servicebio | GB154327 | |
| 多重免疫组化 | 抗CD4抗体 | Servicebio | GB15064 |
| 抗CD63抗体 | Proteintech | 25682-1-AP | |
| 抗cTNT抗体 | Santa Cruz | sc-20025 | |
| 鼠兔双标三色荧光检测试剂盒 | Immunoway | RS0036 | |
| 切片扫描 | Pannoramic MIDI扫描系统 | 3DHISTECH | -- |
| 荧光观察 | Nikon Eclipse Ts2荧光倒置显微镜 | Nikon | -- |
| 离体成像 | DiR染料 | MCE | HY-D1048 |
| Newton 7.0活体成像系统 | Vilber | -- | |
| 血清生化检测 | Rayto Chemray 800全自动生化分析仪 | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | -- |
| RNA-seq | MGIEasy Fast mRNA文库构建试剂盒 | MGI | 940-000890-00 |
| MGISEQ-2000测序仪 | MGI | -- | |
| 亚铁离子检测 | 亚铁离子含量检测试剂盒 | Solarbio | BC5415 |
| 吸光度检测 | SpectraMax i3x酶标仪 | Molecular Device | -- |
| MDA检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A003-1-2 |
| ELISA | 抗ANP抗体 | Proteintech | 27426-1-AP |
| 抗BNP抗体 | Bioss | bs-0044R | |
| HRP标记山羊抗兔IgG抗体 | Invitrogen | 31460 | |
| 流式细胞术 | C11-BODIPY 581/591 | MCE | HY-D1301 |
| 二氢乙锭 | Beyotime | S00635 | |
| 实时定量PCR | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| RevertAid逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| TB Green预混液 | TaKaRa | -- | |
| CFX PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| ECL检测试剂盒 | 4A Biotech | 4AW011 | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 弱碱性剥离缓冲液 | Beyotime | P0025B | |
| 抗GAPDH抗体 | Servicebio | GB15002 | |
| 抗β-MHC抗体 | Proteintech | 22280-1-AP | |
| 抗α-MHC抗体 | Proteintech | 22281-1-AP | |
| 抗Vinculin抗体 | Abcam | ab129002 | |
| 抗TSG101抗体 | Abcam | ab125011 | |
| 抗Calnexin抗体 | Proteintech | 10427-2-AP | |
| 抗GPX4抗体 | Proteintech | 67763-1-Ig | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体 | Invitrogen | 31430 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ISO诱导小鼠心脏肥大模型 | ISO剂量10 mg/kg，给药途径和频率（s.c. q.d. 14天或b.i.d. 3天），对照组溶剂0.1% Vitamin C in normal saline，每组n=4或5 阅读提示：Methods 2.1.2、2.1.3、2.1.4及Figure 3、4、8图注 |
| cEVs/jEVs体外处理心肌细胞 | ISO浓度在方法中为5 μg/L、图注中为5 μmol/L，处理24 h；cEVs/jEVs浓度50 μg/mL；FOXP3-jEVs与Veh-jEVs对比浓度25 μg/mL 阅读提示：Methods 2.2及Figure 1、5、6、7图注，注意方法与图注ISO单位不一致 |
| EVs体内给药 | cEVs 10 mg/kg单次i.v.；FOXP3-jEVs与Veh-jEVs 5 mg/kg每三天i.v.；DiR标记后6、24、48、72 h成像 阅读提示：Methods 2.1.3、2.1.4、2.9及Figure 4、8图注 |
| GW4869抑制EV产生 | 剂量1 mg/kg i.p. q.d.，处理时间方法中为3天、图注中为2天，每组n=6 阅读提示：Methods 2.1.1及Figure 2C图注 |
| 工程化FOXP3-jEVs构建 | 慢病毒感染MOI=10，polybrene 10 μg/mL，嘌呤霉素筛选2 mg/mL、维持1 mg/mL，感染后培养时间 阅读提示：Methods 2.4及Figure 7 |