建立MI后丙二酸给药模型并进行多组学图谱分析
定义SDH抑制后成年心脏损伤反应的转录和表观遗传景观。
8周龄雄性CD-1小鼠接受假手术或MI手术，随后每日腹腔注射生理盐水或二甲基丙二酸14天，取心脏进行整合snRNA-seq和snATAC-seq，注释细胞类型并分析亚群。
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琥珀酸脱氢酶抑制后调控多细胞心脏修复的代谢-表观遗传开关
A metabolic-epigenetic switch governs multicellular cardiac repair following succinate dehydrogenase inhibition
实验完整度
高包含snRNA-seq/snATAC-seq、CUT&RUN、靶向代谢组学、心肌细胞与肌成纤维细胞特异性Sdhb敲除小鼠模型及hiPSC-CM体外验证，覆盖多证据层级和功能验证
主要模型
成年CD-1小鼠心肌梗死模型 心肌细胞特异性Sdhb敲除小鼠（Sdhbcko） 肌成纤维细胞特异性Sdhb敲除小鼠（Sdhbfko） 人iPSC来源心肌细胞（hiPSC-CM）
重点核对
丙二酸剂量100 mg/kg，每日腹腔注射，持续14天 Sdhbcko诱导：他莫昔芬75 mg/kg连续5天（基础研究）或120 mg/kg MI前1天并持续他莫昔芬饲料 Sdhbfko诱导：单次他莫昔芬注射后MI，并持续他莫昔芬饲料至MI后4周 hiPSC-CM处理浓度：丙二酸500 μM、8 mM、16 mM；琥珀酸、L-苹果酸、α-KG、富马酸均为500 μM NMCF处理：TGFβ1 10 ng/mL，丙二酸5 mM，处理48小时
摘要
成年哺乳动物心脏再生能力有限，因为心肌细胞增殖受限且纤维化持续存在。我们此前证明，用丙二酸瞬时药理性抑制琥珀酸脱氢酶（SDH）可促进心肌梗死后的再生。在此，我们整合单核RNA测序和ATAC测序，揭示该反应背后的多细胞转录和表观遗传重编程。细胞特异性Sdhb缺失剖析了SDH抑制的贡献；心肌细胞特异性Sdhb缺失短暂增加心肌细胞增殖，但未改善心肌梗死后功能，而肌成纤维细胞特异性Sdhb缺失抑制肌成纤维细胞活化和纤维化并改善心脏功能。SDH抑制促进还原性线粒体代谢，并重塑心肌细胞和成纤维细胞中H3K4me3标记和H3K27me3标记的染色质状态。整合CUT&RUN、染色质可及性和转录谱分析，确定了连接代谢和表观遗传重塑与再生反应的调控靶点。总之，这些发现确立SDH作为心脏再生的多细胞调节因子，并定义了促成瞬时药理性SDH抑制再生效应的不同细胞特异性机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 瞬时药理性SDH抑制如何通过多细胞转录、代谢和表观遗传程序驱动心肌梗死后心脏再生，以及心肌细胞和成纤维细胞中SDH抑制各自的贡献是什么。
- 核心机制
- SDH抑制触发心肌细胞还原性线粒体代谢和H3K4me3/H3K27me3染色质状态重塑，促进再生相关基因表达；在成纤维细胞中则降低H3K4me3并抑制肌成纤维细胞活化，从而协调多细胞修复反应。
- 主要证据
- snRNA-seq/snATAC-seq显示丙二酸处理后心肌细胞和成纤维细胞出现再生和抗纤维化转录及染色质可及性变化；CUT&RUN证实H3K4me3和H3K27me3在响应基因位点重分布；心肌细胞特异性Sdhb缺失短暂增加心肌细胞增殖但未改善心功能，肌成纤维细胞特异性Sdhb缺失减少纤维化并改善心功能；hiPSC-CM中丙二酸、琥珀酸和苹果酸促进增殖。
- 研究意义
- 确立SDH作为连接线粒体功能与表观遗传调控的心脏再生代谢靶点，提示瞬时代谢干预可驱动内源性再生机制而不造成永久重编程，为重新激活损伤成人心肌发育程序提供代谢-表观遗传治疗轴。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
心肌细胞特异性Sdhb敲除的表型分析
确定心肌细胞内在SDH抑制是否足以驱动心肌细胞增殖及心脏修复。
使用他莫昔芬诱导的αMHC-MerCreMer;Sdhbfl/fl小鼠，在诱导后2周和4周评估SDHB蛋白、心功能、心肌细胞增殖标志物、心肌细胞大小和纤维化；并在MI后评估持续敲除的效果。
肌成纤维细胞特异性Sdhb敲除的表型分析
确定肌成纤维细胞中SDH抑制对纤维化和心脏功能的作用。
使用他莫昔芬诱导的Postn-MerCreMer;Sdhbfl/fl小鼠，MI后1天单次他莫昔芬注射并持续他莫昔芬饲料，在MI后1、2、4周评估心功能、瘢痕面积、POSTN、COL3A1、α-SMA表达及心肌细胞增殖。
靶向代谢组学、线粒体超微结构和组蛋白修饰分析
揭示Sdhb敲除后心肌细胞代谢和表观遗传重塑与增殖窗口的关系。
在Sdhbcko小鼠诱导后2周和4周，进行靶向代谢组学（有机酸和氨基酸）、透射电镜观察线粒体和肌节超微结构、Western blot检测组蛋白甲基化和乙酰化修饰。
hiPSC-CM体外验证代谢物促增殖作用
确定SDH抑制后改变的TCA循环代谢物是否足以促进人心肌细胞增殖。
人iPSC来源心肌细胞分别用丙二酸、琥珀酸、L-苹果酸、富马酸、α-酮戊二酸处理，通过EdU掺入和ACTN2染色评估增殖和细胞数。
CUT&RUN解析丙二酸处理后组蛋白修饰重塑
验证丙二酸诱导的转录程序是否伴随H3K4me3和H3K27me3染色质状态改变。
从MI后生理盐水或丙二酸处理14天的心脏中分离心肌细胞和成纤维细胞，进行H3K4me3和H3K27me3的CUT&RUN测序，并与snRNA-seq差异表达基因进行交叉验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 二甲基丙二酸 | Sigma | 108-59-8 |
| 基因诱导 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 增殖标记 | 溴脱氧尿苷 | MP Biomedical | B9285 |
| 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | MedChemExpress | HY-118411 | |
| 免疫荧光 | 抗PCM1抗体 | Sigma | HPA023374 |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab279653 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3 S10抗体 | Invitrogen | MA5-15220 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3 S10抗体 | Millipore | 06-570 | |
| 抗Aurora B抗体 | Sigma | A5102 | |
| 抗心肌肌钙蛋白T抗体 | Abcam | ab8295 | |
| 抗BrdU抗体 | Abcam | ab1893 | |
| 抗PDGFRα抗体 | Cell Signaling Technology | 3174 | |
| 免疫荧光和Western blot | 抗SDHB抗体 | Abcam | ab14714 |
| 免疫荧光 | 抗骨膜蛋白抗体 | Abcam | ab14041 |
| 免疫荧光和Western blot | 抗III型胶原蛋白抗体 | Abcam | ab184993 |
| 免疫荧光 | 抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Invitrogen | 14-5698-82 |
| 免疫荧光和Western blot | 抗波形蛋白抗体 | ABclonal | a19607 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记小麦胚芽凝集素 | Life Technologies | 1853992 |
| 免疫荧光封片 | Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 |
| 抗原修复 | 抗原修复液 | eBioscience | 00-4955-58 |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP |
| 抗H3K4me1抗体 | Abcam | ab8895 | |
| 抗H3K4me2抗体 | Abcam | ab39141 | |
| 抗H3K4me3抗体 | Abcam | ab8580 | |
| 抗H3K9me1抗体 | Abcam | ab8896 | |
| 抗H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 抗H3K27me3抗体 | Abcam | ab192985 | |
| 抗H3K36me3抗体 | Abcam | ab9050 | |
| 抗H3K79me3抗体 | Abcam | ab2621 | |
| 抗H4K20me3抗体 | Abcam | ab9053 | |
| 抗H3K9乙酰化抗体 | Sigma-Aldrich | 06-942 | |
| 抗H3K14乙酰化抗体 | Sigma-Aldrich | 07-353 | |
| 抗H3K27乙酰化抗体 | Abcam | ab4729 | |
| 抗H3乙酰化抗体 | Sigma-Aldrich | 06-599 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | 78440 | |
| BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 | |
| NMCF分离 | 胶原酶B | Worthington | LS004176 |
| 胰酶 | Sigma | P3292 | |
| NMCF处理 | 人转化生长因子β1 | R&D Systems | 100-21 |
| 二甲基丙二酸 | Sigma | 136411 | |
| EdU检测 | EdU | Invitrogen | C10338 |
| hiPSC-CM处理 | α-酮戊二酸 | Sigma | 13192-04-6 |
| 琥珀酸 | MedChemExpress | HY-Y0808 | |
| 富马酸 | Sigma | 624-49-7 | |
| L-苹果酸 | Sigma | 617-55-0 | |
| 心脏灌流 | II型胶原酶 | Worthington | LS004176 |
| 非心肌细胞分离 | 胶原酶/中性蛋白酶 | Roche | -- |
| 流式细胞术 | Ghost Dye violet 450活性染料 | Cytek | 13-0863-T100 |
| MEFSK4-PE抗体 | Miltenyi Biotech | 130-120-166 | |
| ITGA7-Alexa Fluor 700抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-23607 | |
| snRNA-seq/snATAC-seq建库 | Chromium细胞核分离试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000493 |
| Chromium Next GEM单细胞多组学ATAC+基因表达试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000283 | |
| CUT&RUN | CUT&RUN试剂盒 | Cell Signaling Technology | 86652S |
| 兔抗H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| IgG XP同型对照 | Cell Signaling Technology | 66362 | |
| 兔抗H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9733 | |
| Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28006 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | New England Biolabs | E7645L | |
| NEBNext多重寡核苷酸 | New England Biolabs | E7600S | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| 超声心动图 | Vevo 770成像系统 | VisualSonics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MI后丙二酸给药与多组学取样 | 丙二酸剂量100 mg/kg，每日腹腔注射14天；每组4个心脏混合；8周龄雄性CD-1小鼠 阅读提示：Methods中Animal models和Drug administration段落，Fig. 1a |
| 心肌细胞特异性Sdhb敲除 | 他莫昔芬诱导方案（基础研究75 mg/kg连续5天；MI研究120 mg/kg MI前1天+他莫昔芬饲料）；Sdhbfl/fl对照；评估时间点2周和4周 阅读提示：Methods中Animal models段落，Fig. 4a和Fig. 5a |
| 肌成纤维细胞特异性Sdhb敲除 | 单次他莫昔芬注射后MI，持续他莫昔芬饲料；Postn-MerCreMer;Sdhbfl/fl小鼠；MI后4周评估心功能和瘢痕 阅读提示：Methods中Animal models段落，Fig. 7a |
| snRNA-seq/snATAC-seq | 每样本10,000个核；4个心脏混合；测序平台NovaSeq 6000；Cell Ranger ARC 3.0分析 阅读提示：Methods中snRNA & ATAC sequencing段落 |
| CUT&RUN | 每组2个生物学重复；约250,000个细胞/条件；H3K4me3和H3K27me3抗体浓度1:50；测序平台Element Biosciences AVITI 阅读提示：Methods中CUT&RUN sequencing段落，Fig. 8a |
| hiPSC-CM代谢物处理 | 丙二酸浓度500 μM、8 mM、16 mM；琥珀酸、L-苹果酸、富马酸、α-KG均为500 μM；处理3天和9天；EdU掺入24小时 阅读提示：Methods中hiPSC-derived CM differentiation, culture and treatment段落，Extended Data Fig. 7 |
| NMCF体外实验 | TGFβ1 10 ng/mL；丙二酸5 mM；处理48小时；EdU 10 μM孵育24小时 阅读提示：Methods中NMCF isolation, culture and treatment段落，Extended Data Fig. 8 |