鉴定小鼠和人子宫单核细胞与巨噬细胞的周期动态
明确单核细胞和巨噬细胞在生殖周期中的数量变化及单核细胞对巨噬细胞池的补充。
建立流式门控策略区分小鼠Ly6Chi单核细胞和Ly6C−巨噬细胞以及人CCR2+单核细胞和CCR2−巨噬细胞，检测不同动情周期和月经周期阶段的细胞比例和绝对数；利用腹部屏蔽照射的CD45.1/CD45.2骨髓嵌合体追踪巨噬细胞补充。
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子宫单核细胞在健康与疾病状态下整个生殖周期中调控组织稳态的双重作用
The dual roles of uterine monocytes in regulation of tissue homeostasis throughout reproductive cycles in health and disease
实验完整度
高包含小鼠模型、人子宫内膜样本、体外分选细胞、scRNA-seq、流式、成像质谱和骨髓嵌合体等多层级证据及功能与机制验证
主要模型
C57BL/6J小鼠子宫组织 Ccr2−/−小鼠子宫组织 人子宫内膜活检样本 CD45.1/CD45.2骨髓嵌合体小鼠
重点核对
小鼠动情周期分期（阴道涂片）及人月经周期分期（基于周期长度和末次月经） 流式细胞术门控策略：小鼠Ly6Chi单核细胞与Ly6C−巨噬细胞，人CCR2+CD14+单核细胞与CCR2−CD14+巨噬细胞 TGFβ阻断抗体（克隆1d11.16.8）腹腔注射0.5 mg隔日一次共2周 Ifngr1−/−小鼠与WT小鼠比较Mac1/Mac2巨噬细胞比例 Ccr2−/−小鼠与WT小鼠比较单核细胞、巨噬细胞亚群、胶原沉积和生育能力
摘要
子宫在反复的组织降解、修复和重塑周期中会发生炎症，但免疫系统如何参与维持子宫组织完整性的机制尚不清楚。我们发现，子宫单核细胞在组织重塑和炎症中具有双重作用，且取决于生殖周期阶段。循环中的炎性单核细胞浸润子宫，随后分别依赖干扰素-γ和转化生长因子-β分化为促炎或促修复巨噬细胞。人类单核细胞数量在植入窗口前达到峰值，此时胚胎植入需要炎症环境。子宫单核细胞表现出细胞毒性特性，调控上皮细胞凋亡。受体-配体相互作用的生物信息学分析表明，单核细胞主导髓系细胞与成纤维细胞之间的相互作用。这些通路在子宫纤维化中被破坏，表现为炎性单核细胞或巨噬细胞过多以及生殖周期节律性丧失。这些数据揭示了单核细胞及其子代在调控子宫组织稳态中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 子宫单核细胞是否以及如何在生殖周期中调控子宫组织稳态，其功能障碍是否与生殖疾病相关。
- 核心机制
- 循环炎性单核细胞浸润子宫后，分别依赖IFNγ和TGFβ分化为促炎Mac1和促修复Mac2巨噬细胞；单核细胞通过细胞毒性（穿孔素、颗粒酶B）调控上皮细胞凋亡，并通过与成纤维细胞和ECM相互作用参与组织重塑。
- 主要证据
- 小鼠和人子宫流式细胞术、scRNA-seq、bulk RNA-seq、骨髓嵌合体、Ccr2−/−和Ifngr1−/−小鼠、TGFβ阻断实验、成像质谱和免疫荧光显示单核细胞周期性波动、分化依赖因子、上皮凋亡调控及ECM相互作用。
- 研究意义
- 揭示单核细胞在子宫组织稳态中的核心作用，并提示这些通路在子宫纤维化（Asherman综合征）中被破坏，为理解生殖疾病提供机制基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组解析子宫髓系细胞异质性及分化轨迹
全面刻画子宫单核细胞和巨噬细胞亚群及其分化关系。
对多个动情周期阶段的小鼠子宫FACS分选髓系细胞进行scRNA-seq，结合Slingshot轨迹分析和GSEA，鉴定单核细胞、中间态细胞、Mac1和Mac2巨噬细胞；用流式验证表面标志物。
验证TGFβ和IFNγ对巨噬细胞亚群分化的作用
确定Mac1和Mac2巨噬细胞分化所依赖的细胞因子。
使用抗TGFβ阻断抗体腹腔注射抑制TGFβ活性，检测Ly6C+MHC-II+炎性中间态细胞、Mac2巨噬细胞比例及Ki-67表达；比较Ifngr1−/−与WT小鼠Mac1/Mac2比例。
验证人子宫单核细胞和巨噬细胞亚群的保守性及功能
确认小鼠发现的单核细胞和巨噬细胞亚群在人子宫内膜中保守并具有相似功能。
FACS分选人子宫内膜CD14+CCR2+单核细胞、CD14+CCR2−CD206− Mac1和CD14+CCR2−CD206+ Mac2巨噬细胞进行bulk RNA-seq；流式检测HLA-DRlo/HLA-DRhi单核细胞亚群、TNF和IL-1β产生、Ki-67和CD31表达。
验证单核细胞的细胞毒性及对上皮细胞凋亡的调控
确定单核细胞是否通过细胞毒性作用调控子宫上皮细胞凋亡。
检测小鼠和人单核细胞及巨噬细胞中颗粒酶B和穿孔素表达；免疫荧光检测WT和Ccr2−/−小鼠子宫Ly6C、CD64和ClC3；流式检测上皮细胞数量。
分析单核细胞与成纤维细胞及ECM的相互作用
探究单核细胞是否参与调控子宫ECM周转和纤维化。
对CD45−子宫细胞进行scRNA-seq鉴定成纤维细胞亚群；Picrosirius Red染色和羟脯氨酸 assay检测胶原；流式检测活化成纤维细胞和肌成纤维细胞；CellChat预测单核细胞与ECM的受体-配体相互作用；评估Ccr2−/−小鼠生育能力。
评估小鼠衰老相关子宫纤维化及人Asherman综合征中的单核细胞/巨噬细胞失调
确定单核细胞和巨噬细胞通路在子宫纤维化中是否被破坏。
比较年轻（<16周）和老年（9–12月）小鼠子宫胶原、成纤维细胞、单核细胞和巨噬细胞；使用成像质谱（Hyperion）分析健康对照和Asherman综合征患者手术前后子宫内膜中单核细胞/巨噬细胞与上皮细胞的空间关系及数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠子宫消化 | 胶原酶D | Sigma-Aldrich | -- |
| 胶原酶V | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小鼠和人子宫消化 | 中性蛋白酶 | Gibco, Invitrogen | -- |
| 人子宫内膜消化 | 胶原酶VIII | Sigma-Aldrich | -- |
| DNase | Sigma-Aldrich | -- | |
| 流式细胞术 | Fc封闭剂 | BioLegend | -- |
| 胞内染色 | eBioscience胞内染色试剂盒 | eBioscience | -- |
| 流式分析 | LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件v10 | Treestar | -- | |
| TGFβ阻断 | 抗TGFβ阻断抗体克隆1d11.16.8 | BioXCell | -- |
| TGFβ阻断对照 | 对照免疫球蛋白G1抗体 | BioXCell | -- |
| 胶原蛋白定量 | QuickZyme Biosciences总胶原蛋白测定试剂盒 | QuickZyme Biosciences | -- |
| 总蛋白定量 | QuickZyme Biosciences总蛋白测定试剂盒 | QuickZyme Biosciences | -- |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠Alexa Fluor-488 | -- | -- |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor-555 | -- | -- | |
| 驴抗兔Alexa Fluor-647 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 成像质谱 | MaxPar多金属标记试剂盒 | Standard BioTools | -- |
| Cell-ID铱嵌入剂 | Standard BioTools | -- | |
| Hyperion成像质谱流式仪 | Standard BioTools | -- | |
| Helios飞行时间质谱流式仪 | Standard BioTools | -- | |
| 细胞因子产生检测 | 莫能菌素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 布雷菲德菌素A | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 骨髓嵌合体 | 恩诺沙星 | Bayer | -- |
| 免疫荧光 | Zeiss Axioscope 5FL-LED荧光显微镜 | Zeiss | -- |
| 成像质谱 | 三维Histech Pannoramic P250玻片扫描仪 | Histech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠动情周期分期 | 阴道涂片细胞比例判定四个动情周期阶段 阅读提示：Methods 'Reproductive cycle staging'，引用文献66 |
| 人月经周期分期 | 基于周期长度、末次月经日期和手术日期；分泌期分为early（1–4天）、mid（5–9天）、late（10–14天） 阅读提示：Methods 'Reproductive cycle staging' |
| 流式细胞术门控 | 小鼠Ly6Chi单核细胞和Ly6C−巨噬细胞；人CCR2+CD14+单核细胞和CCR2−CD14+巨噬细胞，Mac1为CD206−，Mac2为CD206+ 阅读提示：Extended Data Fig. 1a,f；Fig. 4a；Fig. 8k；Methods 'Flow cytometry' |
| TGFβ阻断实验 | 抗TGFβ抗体克隆1d11.16.8，0.5 mg/只，腹腔注射，隔日一次，共2周；对照IgG1；小鼠均在diestrus处死 阅读提示：Methods 'Antibody-mediated TGFβ blockade'；Fig. 3g–i |
| 骨髓嵌合体 | 11 Gy分次照射，腹部铅屏蔽，静脉注射5–10×10^6 CD45.2供体骨髓细胞，重建至少8周；饮水中给予0.03%恩诺沙星 阅读提示：Methods 'Uterus-shielded BM chimeras'；Fig. 1d,e；Fig. 3a,b |
| 子宫消化 | 小鼠：1.25 mg/ml胶原酶D、0.85 mg/ml胶原酶V、1 mg/ml dispase，37°C 40分钟；人：0.5 mg/ml胶原酶VIII、0.65 mg/ml胶原酶D、1 mg/ml dispase、0.015 mg/ml DNase，37°C 35分钟 阅读提示：Methods 'Murine uterus digest'和'Human endometrial biopsy digest' |
| Hyperion成像质谱 | ROI 750×750 μm²，1 μm²像素分辨率，200 Hz；每样本5个ROI 阅读提示：Methods 'Hyperion imaging mass cytometry'和'Hyperion IMC preprocessing, segmentation and analyses' |