构建Rbm5条件敲除与MLL-AF9白血病模型
在体内评估Rbm5对AML发生与LSC维持的作用。
将Rbm5fl/fl与Vav-iCre杂交获得造血特异性敲除，取c-Kit+细胞转导MLL-AF9逆转录病毒并进行原代与二次骨髓移植。
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Rbm5通过Myc驱动的转录环路维持白血病干细胞
Rbm5 sustains leukemia stem cells through a Myc-driven transcriptional circuitry
实验完整度
高含MLL-AF9小鼠模型、条件敲除、scRNA-seq、bulk RNA-seq、AID急性降解、Co-IP、ChIP-seq及PDX与患者样本功能验证
主要模型
MLL-AF9驱动的Rbm5条件敲除小鼠AML模型 人AML细胞系（SEM、OCIAML2、HEK293T） 原代AML患者样本及患者来源异种移植（PDX） 正常c-Kit+造血干/祖细胞与竞争移植小鼠
重点核对
Rbm5条件敲除：Rbm5fl/fl与Vav-iCre杂交，纯C57BL/6J背景，基因组PCR验证
摘要
急性髓系白血病（AML）是一种通常由白血病干细胞（LSC）发育程序失调引起的恶性血液病。在此，我们报道一个此前未被充分认识的RNA结合蛋白Rbm5，它选择性促进小鼠白血病发生、在体内维持LSC自我更新，且对正常造血并非必需。Rbm5在LSC中高表达，其缺失导致LSC功能特异性缺陷，同时抑制自我更新基因表达并诱导髓系分化。多学科机制研究进一步确定Myc是原代白血病细胞中Rbm5的主要且直接转录靶标。此外，RBM5不仅与MYC相互作用，还维持其蛋白水平，从而通过其恰当的基因组范围占据维持Myc下游转录网络。强制表达Myc足以挽救Rbm5缺失的LSC缺陷。因此，我们的研究表明Rbm5通过非经典转录机制调控AML LSC程序，为靶向Rbm5的治疗提供了有力依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Rbm5是否在体内调控AML白血病发生，其对LSC与正常HSC的作用是否具有选择性，以及其分子机制为何。
- 核心机制
- RBM5与MYC物理互作并维持MYC蛋白水平，通过恰当的基因组占据维持MYC下游自我更新转录网络；Rbm5缺失降低Myc蛋白，破坏LSC自我更新程序。
- 主要证据
- MLL-AF9小鼠模型显示Rbm5缺失延长潜伏期、减少L-GMP与克隆形成；scRNA-seq与bulk RNA-seq显示自我更新基因下调和髓系分化基因上调；AID急性降解、Co-IP与ChIP-seq证实RBM5-MYC互作与基因组占据；Myc过表达挽救Rbm5缺失LSC缺陷。
- 研究意义
- 研究提出RBM5-MYC调控轴是非经典转录机制，并提示靶向Rbm5以选择性清除LSC可能是有前景的白血病治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Rbm5缺失对白血病表型与LSC功能的影响
验证Rbm5缺失是否损害白血病发生与干性。
进行克隆形成、生存分析、脾重、形态学、流式检测髓系标志与凋亡、L-GMP比例、体外极限稀释及Rbm5回补实验。
评估Rbm5对正常造血的必要性
判断Rbm5缺失是否影响正常HSC与造血重建。
分析骨髓与外周血各造血群体、克隆形成及竞争性骨髓移植嵌合率。
单细胞与bulk转录组解析分子程序
揭示Rbm5缺失在LSC中影响的基因表达程序。
对原代MLL-AF9白血病细胞与正常c-Kit+细胞进行10× scRNA-seq与bulk RNA-seq，行差异表达、GSEA与KEGG分析。
验证RBM5-MYC互作、蛋白维持与基因组占据
确定Rbm5调控Myc的机制层级。
在AID-RBM5 SEM细胞中5-Ph-IAA急性降解RBM5，检测MYC mRNA与蛋白；Co-IP与质谱检测互作；MYC-HaloTag ChIP-seq检测占据变化。
Myc过表达挽救Rbm5缺失LSC缺陷
验证Myc是Rbm5下游的功能性效应因子。
在Rbm5缺失原代白血病细胞过表达Myc，行克隆形成、LDA、体内移植、外周血GFP+负荷与L-GMP检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠品系 | Rbm5fl/fl敲入小鼠 | GemPharmatech Co., Ltd | -- |
| Vav-iCre转基因小鼠 | The Jackson Laboratory | -- | |
| C57BL/6J（CD45.2）小鼠 | GemPharmatech Co., Ltd. | N000013 | |
| B6-CD45.1小鼠 | GemPharmatech Co., Ltd. | T054816 | |
| 流式分析 | CD45.1抗体 | Biolegend | 110728 |
| CD45.2抗体 | Biolegend | 109830 | |
| 病毒转染 | jetPRIME转染试剂 | -- | -- |
| 克隆形成实验 | MethoCult甲基纤维素培养基 | STEMCELL Technologies | M3434 |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3' v2试剂盒 | 10× Genomics | -- |
| Chromium控制器 | 10× Genomics | -- | |
| Illumina HiSeq X Ten测序仪 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| AID系统处理 | 5-苯基吲哚-3-乙酸 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MLL-AF9白血病模型与移植 | 细胞剂量（原代约5×10^4+5×10^5支持细胞；二次约2×10^5）、照射剂量（900 cGy/450 cGy）、小鼠周龄8周与性别（雌性） 阅读提示：Materials and methods“Leukemic transplants and BM competitive transplantation”及Fig. 1A图注 |
| Rbm5条件敲除验证 | Rbm5fl/fl与Vav-iCre杂交策略、C57BL/6J背景、外显子3-4缺失的基因组PCR验证 阅读提示：Materials and methods“Mice”与Fig. 1A、Fig. 2B图注及Supplementary Table 1 |
| LSC群体与干性检测 | L-GMP门控定义（GFP+Lin-Sca1-IL-7R-c-Kit+CD34+CD16/32+）与LDA分组；各组样本量 阅读提示：Fig. 1J、1K图注及Results“Rbm5 promotes murine AML development and progression” |
| Myc挽救实验 | MSCV-EV/Rbm5/Myc质粒与jetPRIME转染、嘌呤霉素1 μg/mL筛选72 h、每孔1×10^4细胞、5天计数、体内5×10^5细胞注射 阅读提示：Materials and methods“In vivo and in vitro rescue experiments”与Fig. 6图注 |
| AID急性降解与ChIP-seq | 5-Ph-IAA浓度1 μM与处理时间1/6/24 h、MYC-HaloTag表达、ChIP-seq两组生物学重复 阅读提示：Fig. 5E–M图注及Results“RBM5 controls the MYC transcriptional activity…” |
| 转录组分析 | scRNA-seq质控阈值（<300基因或>10%线粒体基因剔除）、RNA-seq每组3个生物学重复、差异阈值FDR<0.05且Log2FC>1 阅读提示：Materials and methods“Single-cell RNA sequencing…”、“Software and statistical analysis”及Fig. 4A图注 |
| 统计与样本量 | 样本量依据前期功效分析、每组至少3只小鼠、未设盲、统计检验方法选择 阅读提示：Materials and methods“Software and statistical analysis” |