发现队列单细胞转录组分析
鉴定致死性融合阴性RMS与融合阳性RMS是否存在共同转录状态
对16例儿童RMS新鲜肿瘤组织及2例Ewing肉瘤对照行10x单细胞mRNA测序，聚类并计算趋同指标。
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高危横纹肌肉瘤具有一个趋同的细胞状态
High-Risk Rhabdomyosarcomas Feature a Convergent Cell State
实验完整度
高含体外类器官扰动、单细胞/单核RNA-seq、ATAC-seq、空间转录组、患者样本及多队列验证和功能验证
主要模型
儿童RMS原发肿瘤新鲜组织 RMS类器官模型RMS000OYW和RMS444 RMS细胞系RH30、RH41、RD、TE381.T、TE441.T 患者来源石蜡包埋组织样本
重点核对
发现队列：16例儿童RMS肿瘤新鲜组织，另2例Ewing肉瘤对照 扩展队列：24例儿童27份新鲜冷冻组织，行单核RNA和ATAC测序 空间转录组：9例样本Xenium 5K基因表达面板检测 类器官扰动：PAX3–FOXO1或tdTomato对照转染RMS000OYW和RMS444，单细胞mRNA测序 IHC验证：10例RMS石蜡组织，FGFR4和CDH15染色
摘要
体细胞突变常可预测儿童癌症的生存，如横纹肌肉瘤（RMS）中FOXO1基因融合状态是关键预后特征。在本研究中，我们检测了单细胞转录组，发现致死性疾病的癌细胞无论融合状态如何，都趋同于一个具有共享转录景观的共同细胞状态。核转录组学、染色质可及性、空间转录组学、扰动研究和先前发表的数据集验证了这一总体高危细胞状态。该趋同细胞状态仅部分重叠于FOXO1融合的转录效应，并意外表现出神经特征。总体而言，这些发现描绘了高危RMS细胞的一种细胞状态，超越了传统分子和组织学界限，提示了一种总体疾病表型，可能改变靶点发现并指导临床实践。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 致死性融合阴性RMS是否与融合阳性RMS共享一个超越融合状态和组织学的高危癌细胞状态？
- 核心机制
- 致死性融合阴性RMS癌细胞在转录组上趋同于融合阳性RMS细胞，形成以肌肉样转录组为主、部分重叠FOXO1融合效应并含神经特征的高危细胞状态。
- 主要证据
- 发现队列和扩展队列单细胞/单核RNA-seq、ATAC-seq、Xenium空间转录组、类器官过表达PAX3–FOXO1扰动实验及外部数据集验证显示高危组趋同指标和高危模块评分显著升高。
- 研究意义
- 提出超越传统分子和组织学界限的高危RMS细胞状态，为理解侵袭性疾病提供生物学见解，并提名潜在生物标志物和治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
扩展队列单核RNA和ATAC测序验证
在独立队列中验证高危细胞状态并评估转录因子染色质可及性
对24例儿童27份新鲜冷冻组织行单核RNA和ATAC测序，计算高危模块评分和趋同指标，并用chromVAR评估TF基序可及性。
空间转录组验证
在空间维度验证高危转录程序的存在和定位
对9例RMS样本行Xenium 5K基因表达面板检测，计算高危评分并分析空间自相关。
类器官过表达PAX3–FOXO1扰动实验
明确FOXO1融合对趋同细胞状态的诱导作用及其与高危转录组的关系
在融合阴性RMS类器官RMS000OYW和RMS444中过表达PAX3–FOXO1或tdTomato对照，行单细胞mRNA测序比较。
候选细胞表面靶点的蛋白水平验证
验证单细胞转录组提名的高危相关细胞表面靶点
对10例RMS石蜡组织行FGFR4和CDH15免疫组化；用流式细胞术检测RMS细胞系和原发肿瘤样本的CHRNG表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | IV型胶原酶 | MP Biomedicals | 11410982 |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | BioLegend | 420301 |
| CD45+细胞去除 | CD45磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 |
| 死细胞去除 | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 |
| 单细胞文库构建 | Chromium单细胞3′试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Chromium单细胞5′试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| 单核多组学文库构建 | Chromium Next GEM多组学ATAC+基因表达 | 10x Genomics | CG000338 |
| DNA/RNA提取 | AllPrep DNA/RNA迷你试剂盒 | QIAGEN | -- |
| QIAcube自动化纯化仪 | QIAGEN | -- | |
| DNA/RNA质控 | Agilent 4200 TapeStation系统 | Agilent | -- |
| DNA质控 | 基因组DNA ScreenTape检测 | Agilent | 5067-5365 |
| RNA质控 | 高灵敏度RNA ScreenTape检测 | Agilent | 5067-5579 |
| 空间转录组 | Xenium 5K基因表达面板 | 10x Genomics | PN-1000724 |
| Xenium Prime样本制备试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000720 | |
| Xenium细胞分割染色试剂 | 10x Genomics | PN-1000661 | |
| Xenium载玻片 | 10x Genomics | PN 3000941 | |
| 免疫组化 | FGFR4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-136988 |
| CDH15抗体 | Invitrogen | PA5-11489 | |
| 流式细胞术 | B7-H3 MIH42抗体 | BioLegend | -- |
| mAb131抗体 | -- | -- | |
| Amicon Ultra-15离心过滤单元 | Merck Millipore | -- | |
| rProtein A GraviTrap系统 | GE Healthcare | -- | |
| 抗体缓冲液试剂盒 | Cytiva | -- | |
| 类器官转染 | pLV-EF1a-PAX3FOXO1-PGK-puro质粒 | VectorBuilder | VB220603-1030fex |
| pLV-EF1a-tdTomato-PGK-puro质粒 | VectorBuilder | VB900122-1868kvz |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 发现队列样本与分组 | 16例儿童RMS分组：4例融合阳性、4例致死性融合阴性、8例存活融合阴性；2例Ewing肉瘤对照；随访中位44个月 阅读提示：Results中“Overview of the discovery and extension cohorts”及Supplementary Table S1 |
| 扩展队列样本与分组 | 24例儿童27份样本，含7例融合阳性、17例融合阴性；2例骨肉瘤和1例DSRCT对照；MYOD1突变状态 阅读提示：Results中扩展队列描述、Fig. 3B及Supplementary Table S1 |
| 趋同指标计算 | 肌肉评分与非肌肉间充质综合评分的log2比值，趋同阈值>0；间充质模块基于人胎儿结缔组织图谱 阅读提示：Materials and Methods中“Derivation of mesenchymal lineage gene modules using the human cell atlas”及Fig. 2 |
| 类器官扰动实验 | RMS000OYW和RMS444类器官，PAX3–FOXO1或tdTomato对照慢病毒转染，抗生素选择后培养17至24天，单细胞mRNA测序 阅读提示：Materials and Methods中“PAX3–FOXO1 overexpression in fusion-negative RMS tumoroid models”及Fig. 5A |
| 空间转录组 | 9例样本，Xenium 5K面板，10微米切片，探针杂交16至24小时，细胞分割和质控阈值 阅读提示：Materials and Methods中Xenium相关小节及Fig. 4 |