构建空间域识别与scRNA-seq参考图谱
克服PanIN微小且难以分离的限制，定义上皮和基质空间域。
整合scRNA-seq与Visium空间转录组，采用空间感知聚类和spot去卷积，结合组织学注释定义17个空间域。
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上皮和基质的异步演化区分前驱病变与胰腺癌
Asynchronous Evolution of Epithelium and Stroma Differentiates Precursor Lesions from Pancreatic Cancer
实验完整度
高多层级证据：scRNA-seq、Visium、Xenium/CosMx、TCGA、IF、类器官-成纤维细胞共培养功能验证
主要模型
人供体胰腺组织（含散发性PanIN） 胰腺导管腺癌（PDAC）患者肿瘤组织 患者来源肿瘤类器官与CAF/正常成纤维细胞3D共培养 外周血单核细胞来源M0巨噬细胞
重点核对
Visium空间转录组样本：健康供体含PanIN 5例（另验证队列6例）、初治PDAC 7例、癌旁正常2例 scRNA-seq图谱：健康供体24例、癌旁正常3例、PDAC 18例，共>200k细胞 肿瘤类器官与CAF或正常成纤维细胞按1:2比例在Type II Cultrex中3D共培养3天 M0巨噬细胞用50%肿瘤类器官条件培养基处理48小时，qPCR检测SPP1和MARCO IF验证pERK、pSTAT1、pSTAT3、LRRC15、SMA、LEF1等蛋白表达与空间分布
摘要
胰腺上皮内瘤变（PanIN）是胰腺癌的前驱病变，而胰腺癌是一种以广泛肿瘤微环境为特征的致命疾病。微环境在癌症进展过程中如何演化在很大程度上仍不清楚，因为PanIN是微观病变，无病变的胰腺样本极其罕见，而癌旁正常样本会受到恶性肿瘤存在的影响。利用供体器官和空间技术，我们绘制了从PanIN到癌症的演化图谱。PanIN上皮成分与癌症处于连续谱上，而PanIN微环境则截然不同。向癌症的进展伴随着髓系细胞和淋巴细胞深刻的地理重组，以及一个以高水平平滑肌肌动蛋白、LRRC15和WNT信号组分LEF1为特征的癌症特异性成纤维细胞群体的形成。总之，我们的数据表明在胰腺癌发生过程中上皮和基质成分的异步演化。缺乏基质重编程可能解释为什么大多数PanIN不进展为癌症。汇编数据可在https://www.pancreas-precancer-atlas.com/获取。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人散发性PanIN的微环境在胰腺癌进展过程中如何演化，及其与上皮成分演化是否同步。
- 核心机制
- PanIN上皮成分与癌症处于转录连续谱，但基质微环境未发生重编程；癌症进展伴随髓系/淋巴细胞地理重组及SMA、LRRC15、LEF1高表达癌症特异性成纤维细胞（Fibro2）的出现，WNT信号可能参与肿瘤上皮与成纤维细胞互作。
- 主要证据
- Visium空间转录组和scRNA-seq图谱显示PanIN上皮与GLTumor连续、而PanIN微环境类似正常导管；IF验证pSTAT3等上皮信号及LRRC15/SMA/LEF1成纤维细胞；Xenium/CosMx验证Fibro2近肿瘤富集；类器官-CAF共培养显示肿瘤类器官驱动CAF中LEF1表达。
- 研究意义
- 揭示PanIN微环境缺乏肿瘤微环境关键特征，可能解释大多数PanIN不进展为癌症，并为旨在阻止肿瘤许可性环境形成的干预策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较良性与肿瘤上皮域的转录轨迹
验证PanIN上皮是否与癌症处于连续演化轨迹。
对空间域进行PCA、伪时间轨迹分析和上皮特异性去卷积表达差异分析，并用IF检测pERK、pSTAT1、pSTAT3。
分析上皮域邻近微环境组成
判断PanIN微环境是否已获得肿瘤微环境特征。
以指定上皮域为中心150 μm半径内的spot比例定义邻域，比较导管、PanIN、GLTumor和PDTumor周围空间域组成。
鉴定肿瘤特异性成纤维细胞域及亚型
明确癌症相关成纤维细胞是否在PanIN阶段已出现。
对Fibro2和Fibro3域进行成纤维细胞特异性去卷积、差异表达和层次去卷积，结合scRNA-seq定义成纤维细胞亚型。
空间转录组与蛋白水平验证Fibro2特征
在独立数据集和蛋白水平验证肿瘤相关成纤维细胞签名。
利用已发表Xenium和CosMx数据集、TCGA-PAAD及IF染色验证Fibro2签名与肿瘤细胞的邻近关系及LRRC15/SMA/LEF1共表达。
类器官-成纤维细胞共培养功能验证WNT信号互作
验证肿瘤上皮是否驱动CAF中WNT信号靶基因LEF1表达。
将PDAC类器官与匹配CAF或供体正常成纤维细胞按1:2比例3D共培养，scRNA-seq检测WNT配体和LEF1表达；并用肿瘤类器官条件培养基处理M0巨噬细胞检测SPP1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间转录组 | 10x Genomics Visium CytAssist空间转录组平台 | 10x Genomics | -- |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics单细胞测序平台 | 10x Genomics | -- |
| 类器官-成纤维细胞共培养 | II型Cultrex基质胶 | R&D Systems | 3533-010-02 |
| 组织消化 | 胶原酶P | -- | -- |
| 细胞解离 | AccuMax细胞解离液 | Invitrogen | -- |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488酪胺信号放大试剂盒 | Invitrogen | -- |
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | -- | -- | |
| Leica STELLARIS 8显微镜 | Leica | -- | |
| 单核细胞分离 | CD14+单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini RNA提取试剂盒 | -- | -- |
| RT-qPCR | TaqMan Fast Advanced预混液 | Applied Biosystems | -- |
| SPP1 TaqMan引物 | Thermo Fisher Scientific | Hs00959010_m1 | |
| MARCO TaqMan引物 | Thermo Fisher Scientific | Hs00198937 | |
| GAPDH TaqMan引物 | Thermo Fisher Scientific | Hs02786624_g1 | |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪 | Life Technologies | -- | |
| 测序 | HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 空间转录组样本与平台 | 样本类型和数量：健康供体含PanIN 5例、初治PDAC 7例、癌旁正常2例；验证队列6例；平台为10x Genomics Visium CytAssist，spot直径55 μm 阅读提示：Methods的Spatial Transcriptomic Processing小节及Figure 1D、1E图注 |
| scRNA-seq参考图谱构建 | 参考样本数：健康供体24例、癌旁正常3例、PDAC 18例；数据整合方法scVI，聚类分辨率0.2 阅读提示：Methods的scRNA-seq Processing小节 |
| 邻域分析 | 邻域半径150 μm；以导管、PanIN、GLTumor、PDTumor域为中心的spot比例；Wilcoxon秩和检验 阅读提示：Methods的Neighborhood Analysis小节及Figure 4A图注 |
| 类器官-成纤维细胞共培养 | 类器官与CAF或正常成纤维细胞比例1:2；Type II Cultrex（#3533-010-02, R&D Systems）中3D培养3天；培养基为DMEM/F12含5% FBS和1×青霉素/链霉素 阅读提示：Methods的Organoid–Fibroblast Coculture小节及Figure 7D图注 |
| M0巨噬细胞条件培养基处理 | M0巨噬细胞由CD14+单核细胞经M-CSF分化5天；用50%肿瘤类器官条件培养基处理48小时；qPCR检测SPP1和MARCO 阅读提示：Methods的Treating M0 Macrophages with Tumor Organoid CM, RNA Extraction, and Quantitative Real-time PCR小节及Supplementary Fig. S16C |
| 免疫荧光验证 | 抗原修复条件：pSTAT3用EDTA pH 8，其余用10 mmol/L柠檬酸钠pH 6；抗体稀释度见Supplementary Table S14；pERK、pSTAT3 n>10/样本类型，pSTAT1 n=5/样本类型 阅读提示：Methods的Immunofluorescence Staining小节、Supplementary Table S14及Figure 3I–3K、7G–7H图注 |