CRISPR/Cas9构建POU3F2敲除iPSC并分化为NPC
建立POU3F2功能丧失的人类神经发育细胞模型
在三株人iPSC（YZ1、BR33、BR24）中用靶向POU特异性结构域的sgRNA进行CRISPR/Cas9突变，挑选野生型和突变克隆，经双SMAD抑制方案分化为NPC，并通过免疫细胞化学和Western blot验证POU3F2蛋白缺失。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
POU3F2通过SOX13和ADNP调控经典Wnt信号以扩增神经祖细胞群
POU3F2 regulates canonical Wnt signalling via SOX13 and ADNP to expand the neural progenitor population
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9突变iPSC-derived NPCs、脑类器官、患者来源NPCs队列、scRNA-seq、CUT&RUN、IP-MS及功能回补等多层验证
主要模型
人iPSC来源的神经祖细胞（NPCs） POU3F2突变的人脑类器官 ROSMAP队列来源的遗传多样性NPCs CS14人胎儿脑scRNA-seq数据
重点核对
在YZ1、BR33、BR24三株iPSC中利用CRISPR/Cas9靶向POU3F2的POU特异性结构域，每株选择1个野生型克隆和2个突变克隆 NPC分化采用双SMAD抑制经拟胚体中间体方案，含100 nM LDN193189和10 μM SB431542 SUPERTOPFLASH报告基因检测基线及Wnt3a激活的经典Wnt信号，n=9次分化 EdU掺入实验检测增殖，10 μM EdU处理6小时，n=4次分化 在33名ROSMAP个体来源NPCs中进行bulk RNA-seq和GSVA分析POU3F2与Wnt信号关联
摘要
已在神经发育障碍个体中鉴定出转录因子POU3F2的功能丧失突变。为阐明POU3F2在人类神经发育中的机制作用，我们在人类神经祖细胞（NPCs）中诱导了POU3F2破坏。NPCs中POU3F2突变导致基线经典Wnt信号降低和增殖减少，从而导致放射状胶质细胞的过早特化。此外，在遗传多样性NPCs中，POU3F2水平与基线经典Wnt信号显著正相关，与放射状胶质细胞特化标志物负相关。通过一系列无偏分析，我们发现SRY盒转录因子13（SOX13）和活性依赖性神经保护蛋白同源盒（ADNP）是POU3F2的转录靶标，它们介导POU3F2对人类NPCs中Wnt信号的影响。最后，我们描述了五名携带POU3F2功能丧失突变的孤独症谱系障碍个体，增强了其在美国人类神经发育中关键作用的遗传学证据。总之，这些研究将POU3F2定义为经典Wnt信号的激活因子，并在机制上将两个高置信度孤独症基因ADNP和POU3F2在神经发育调控中联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- POU3F2在人类神经发育中通过何种机制发挥作用，其功能丧失如何导致神经发育障碍相关表型。
- 核心机制
- POU3F2作为转录因子直接激活SOX13和ADNP的表达，SOX13增强经典Wnt信号，ADNP则可能负反馈调节Wnt信号 potentiation，共同调控NPC扩增与放射状胶质细胞特化。
- 主要证据
- POU3F2MUT NPCs中基线经典Wnt信号降低、增殖减少、放射状胶质细胞特化增加；SOX13过表达可挽救Wnt信号缺陷；SOX13敲除表型模拟POU3F2缺失；CUT&RUN和IP-MS证实POU3F2直接结合并调控SOX13和ADNP。
- 研究意义
- 将POU3F2定义为经典Wnt信号的激活因子，并在机制上连接两个高置信度孤独症基因ADNP和POU3F2，为理解神经发育障碍和孤独症谱系障碍的分子机制提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
无偏转录组和蛋白质组分析
鉴定POU3F2缺失后NPC中受影响的通路
对POU3F2WT和POU3F2MUT NPCs进行bulk RNA-seq和TMT-MS蛋白质组分析，发现Wnt相关通路下调。
验证经典Wnt信号和增殖表型
检测POU3F2缺失是否影响基线经典Wnt信号和细胞增殖
用SUPERTOPFLASH报告基因检测基线和Wnt3a激活的Wnt信号，用EdU掺入实验检测增殖。
单细胞转录组分析NPC亚型变化
确定POU3F2缺失是否改变NPC亚型组成
对POU3F2WT和POU3F2MUT NPCs进行scRNA-seq，与iPSC来源神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞snRNA-seq及CS14人胎儿脑scRNA-seq数据整合，分析细胞亚群比例和拟时序。
脑类器官验证放射状胶质细胞特化
在3D模型中验证POU3F2缺失导致放射状胶质细胞增加
对POU3F2WT和POU3F2MUT脑类器官切片进行ANXA1、VIM、BLBP免疫染色，量化每个脑室的放射状胶质细胞数量。
时间进程分析确定Wnt信号与放射状胶质特化的时序关系
判断Wnt信号降低是否先于放射状胶质细胞特化
在NPC分化关键时间点（D2拟胚体、D7神经玫瑰花环、D21晚期祖细胞）检测POU3F2表达、基线Wnt信号和ANXA1+放射状胶质细胞比例。
遗传多样性NPC队列分析POU3F2水平与Wnt信号关联
探究POU3F2自然表达变异是否影响Wnt信号和祖细胞身份
对33名ROSMAP个体来源iPSC分化的NPCs进行bulk RNA-seq和GSVA，并在6名高/低表达个体中验证SUPERTOPFLASH，Western blot检测POU3F2与β-catenin相关性。
鉴定POU3F2结合蛋白和直接转录靶标
寻找介导POU3F2对Wnt信号影响的效应分子
在NPCs中进行免疫共沉淀结合TMT-MS鉴定POU3F2相互作用蛋白，并进行CUT&RUN鉴定POU3F2直接结合位点。
验证SOX13和ADNP作为POU3F2效应分子
确定SOX13和ADNP是否介导POU3F2对Wnt信号的调控
在POU3F2WT和POU3F2MUT NPCs中过表达SOX13、ADNP或GFP对照，进行SUPERTOPFLASH检测；并构建SOX13敲除NPCs进行RNA-seq和GSEA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| iPSC基因编辑 | Cas9表达载体 | Addgene | -- |
| NPC分化 | LDN193189 | Stemgent | -- |
| SB431542 | STEMCELL | -- | |
| 层粘连蛋白 | Gibco | -- | |
| STEMdiff神经玫瑰花环选择试剂 | STEMCELL | -- | |
| NPC培养 | 成纤维细胞生长因子2 | Peprotech | -- |
| 生长因子减少型Matrigel | Corning | -- | |
| 脑类器官免疫染色 | ANXA1抗体 | Abcam | 214486 |
| SOX2抗体 | R&D Systems | AF2018 | |
| Nestin抗体 | Novus Biologicals | MAB1259 | |
| VIM抗体 | R&D Systems | MAB2105 | |
| BLBP抗体 | R&D Systems | AF3166 | |
| 免疫细胞化学 | POU3F2抗体 | CST | 12137S |
| PAX6抗体 | Biolegend | 901301 | |
| MAP2抗体 | Abcam | ab5392 | |
| CD44抗体 | Abcam | ab254530 | |
| ADNP抗体 | Abcam | ab300114 | |
| SOX13抗体 | Proteintech | 18902-1 | |
| β-catenin抗体 | CST | 8480S | |
| Western blot | GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| TUJ1抗体 | Novus Biologicals | NB100-1612 | |
| HA标签抗体 | CST | C29F4 | |
| POU3F2抗体 | Santa Cruz | sc-393324 | |
| NuPAGE 4%–12% Bis-Tris凝胶 | ThermoFisher | -- | |
| SeeBlue Plus2标准品 | ThermoFisher | -- | |
| Odyssey封闭液 | LI-COR | -- | |
| RNA提取 | PureLink RNA迷你试剂盒 | ThermoFisher | -- |
| RNA质控 | Tapestation RNA ScreenTape | Agilent | -- |
| SUPERTOPFLASH报告基因实验 | pGL4.49(luc2P/TCF-LEF RE/Hygro)报告质粒 | Promega | -- |
| pRL-CMV海肾荧光素酶质粒 | Promega | -- | |
| Amaxa P3核转染试剂盒 | Lonza | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 人FLAG标签SOX13表达载体 | Origene | RC210697 | |
| 人HA标签ADNP表达载体 | VectorBuilder | -- | |
| pmaxGFP质粒 | Lonza | -- | |
| 增殖实验 | EdU | Invitrogen | -- |
| Hoechst33342 | -- | -- | |
| 单细胞RNA-seq | 10x Chromium控制器 | 10x Genomics | -- |
| 30 μm过滤器 | Sysmex | -- | |
| CUT&RUN | H3K4me3抗体 | CST | 9751 |
| 刀豆蛋白A磁珠 | -- | -- | |
| Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| 免疫共沉淀 | Protein G Dynabeads磁珠 | Invitrogen | -- |
| BS3交联剂 | ThermoFisher | -- | |
| 免疫球蛋白G | ThermoFisher | 02-6102 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| 细胞裂解 | RIPA裂解液 | ThermoFisher | -- |
| cOmplete迷你蛋白酶抑制剂 | Millipore Sigma | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Millipore Sigma | -- | |
| 免疫荧光封片 | VECTASHIELD封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| 免疫荧光封闭 | 驴血清 | Jackson ImmunoResearch | -- |
| 细胞培养 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| Accutase细胞解离液 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR/Cas9基因编辑与克隆选择 | iPSC株系（YZ1、BR33、BR24）；每株系选1个野生型克隆和2个突变克隆；sgRNA靶向POU特异性结构域；突变类型为复合杂合蛋白破坏性突变 阅读提示：Materials and methods中Generation of CRISPR/Cas9-edited iPSCs小节及Supplementary Table 1 |
| NPC分化 | 双SMAD抑制经拟胚体方案；LDN193189 100 nM；SB431542 10 μM；D7添加laminin 1 μg/ml；D14神经玫瑰花环选择；D21后GFR Matrigel高密度扩增至最多三代 阅读提示：Materials and methods中Differentiation of iPSC-derived NPCs小节 |
| SUPERTOPFLASH报告基因实验 | 每百万细胞1.8 μg pGL4.49和0.2 μg pRL-CMV；核转染后24小时换Wnt3a或对照条件培养基；再24小时后检测；基线Wnt信号为Firefly/Renilla，激活Wnt信号为Wnt3a处理比值除以对照比值 阅读提示：Materials and methods中SUPERTOPFLASH luciferase Wnt reporter assay小节及Figure 2A |
| EdU增殖实验 | 30 k cells/well于96孔板；10 μM EdU处理6小时；Hoechst33342复染；CellProfiler计算阳性率 阅读提示：Materials and methods中Proliferation assay小节 |
| 单细胞RNA-seq分析 | 线粒体reads >10%或检测特征<200或>6000的细胞被排除；Harmony回归性别效应；与CS14胎儿脑数据整合时回归来源效应；卡方检验比较细胞类型比例 阅读提示：Materials and methods中Single-cell RNA-seq of POU3F2WT and POU3F2MUT NPCs小节及Figure 3F |
| CUT&RUN | 每反应100 k细胞；POU3F2抗体1:50；H3K4me3抗体1:50；Input经proteinase K和RNase A处理后超声（15循环，30秒开/关，高强度）；测序2×75 bp；MACS2 call peaks，DiffBind评分，HOMER注释 阅读提示：Materials and methods中Cleavage under targets and release using nuclease小节 |
| 免疫共沉淀-质谱 | POU3F2抗体1:50；IgG 0.4 μg/reaction；抗体与Dynabeads交联使用BS3；每株系n=3个样本 阅读提示：Materials and methods中Immunoprecipitation followed by mass spectrometry小节及Figure 6C图注 |
| ROSMAP队列NPC分析 | 33名ROSMAP个体来源iPSC分化的NPCs；GSVA使用Wnt activated基因集；SUPERTOPFLASH在6名个体（3高3低）中验证，n=3次分化；Western blot 33株系，每株系2孔 阅读提示：Materials and methods中Gene set variation analyses小节及Figure 5图注 |