Engineered thoracic spinal cord organoids for transplantation after spinal cord injury
包含体外类器官构建与功能检测、小鼠胸段完全横断SCI移植模型、空间转录组、电生理、光遗传学及神经环路示踪等多层级功能与机制验证。
成纤维细胞来源的诱导多能干细胞（iPSC）生成的胸段脊髓类器官（enTsOrg） 胸段（T9）完全横断脊髓损伤的雌性M-NSG小鼠模型
类器官移植时机：选择体外培养21天的enTsOrg进行移植，并与42天成熟类器官比较 动物模型：雌性M-NSG小鼠（20±2 g，7–8周龄），T9椎板切除并完全横断2 mm脊髓 移植分组：enTsOrg组、sOrg组、Matrigel组、SCI组和sham组，每组n=25 神经电生理检测：MEA记录35天类器官的放电活动；全细胞膜片钳记录sAP、iAP及电压门控Na+/K+电流 体内功能与环路验证：MEP记录、光遗传抑制ChAT+神经元、BDA/PRV神经示踪及BMS评分
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建具有胸段区域异质性和成熟神经元组成的enTsOrg，并验证其形态、基因表达和电生理功能。
将iPSC球体在神经分化阶段包埋于LDH–Matrigel或Matrigel中，经LDN-193189、CHIR99021、RA、purmorphamine及BDNF/GDNF诱导分化，于第14、21、42天收集类器官；通过SEM、RNA-seq、ST-seq、qPCR、免疫荧光、MEA、膜片钳和钙成像检测胸段标志物、神经元亚型及电生理活性。
评估enTsOrg移植对胸段完全脊髓损伤后运动功能恢复的治疗效果，并确定最佳移植时机。
雌性M-NSG小鼠行T9椎板切除和2 mm完全脊髓横断，随机分为enTsOrg、sOrg、Matrigel、SCI和sham组，分别植入21天enTsOrg、21天sOrg、Matrigel或不做处理；通过BMS评分、步态分析、水平梯实验、von Frey和热板实验评估运动与感觉功能。
验证移植类器官在体内的存活、神经发生、成熟及与宿主组织的结构连接。
于移植后1、3、5、7、14周取材，通过TUNEL、BrdU、免疫荧光检测Nestin、SOX2、NeuN、ChAT、ISL1、HOXC9等标志物；通过ST-seq分析移植区细胞组成和发育阶段；通过MEP、PSD95免疫荧光及BDA/PRV示踪评估结构功能连接。
验证enTsOrg移植后是否形成胸段特异性运动神经元亚型、关键中间神经元，并参与宿主神经环路和运动控制。
通过ST-seq、免疫荧光和qPCR检测运动神经元柱亚型（PGC、HMC、MMC）、alpha/gamma运动神经元及Vsx2+/vGlut2+中间神经元；通过光遗传抑制ChAT+神经元并同步记录P-PN放电和MEP，结合行为轨迹分析验证ChAT+神经元对运动功能的贡献。
阐明LDH促进胸段运动神经元分化和移植后神经元存活、成熟的信号机制。
在移植前（21天）和移植后7周/14周检测SHH通路（PTCH1、GLI1、NKX6.1、SHH）、RA通路（CYP26A1、CRABP2、RARα）及PI3K/AKT/GSK3β、UCHL1、MFN2等表达；通过Western blot、qPCR和免疫荧光验证。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与类器官构建 | 基底膜基质胶 | Corning | 354277 |
| mTeSR1培养基 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0004-10 | |
| CHIR99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| 视黄酸 | Stemgent | 04-0021 | |
| purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | |
| 脑源性神经营养因子 | PeproTech | 450-02-10 | |
| 胶质细胞源性神经营养因子 | PeproTech | 450-10-10 | |
| LDH合成 | 硝酸镁 | Sinopharm | 80075918 |
| 钙成像 | Fura-2/AM | Thermo Fisher | F1201 |
| Hank平衡盐溶液 | Beyotime | C0218 | |
| MEA记录 | 多电极阵列板 | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | Yeasen | 40307 |
| 组织包埋与切片 | O.C.T.包埋剂 | SAKURA | 4583 |
| 免疫染色 | 驴血清 | Jackson | 017-000-121 |
| Triton-X | Sigma | X100-100ML | |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | |
| Western blot | BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| 牛血清白蛋白 | CELLGROGEN | C0500-3010 | |
| Tris缓冲盐-Tween溶液 | Solarbio | T1087 | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus | TAKARA | 9108 |
| Primer Script逆转录酶试剂盒 | Takara | 2690 A | |
| TB Green Premix Ex Taq | Takara | RR820A | |
| 神经示踪 | 生物素化葡聚糖胺 | Invitrogen | -- |
| 光遗传学 | rAAV-ChAT-eNpHR3.0-EGFP | BrainCase | -- |
| PRV-CAG-3Ms病毒 | Brain Case | -- | |
| 热板实验 | 热板仪 | Shanghai Yuyan Instruments | YSL-21 |
| 步态分析 | DigiGait成像系统 | Mouse Specifics | -- |
| MEP记录 | Keypoint II双通道诱发电位/肌电图仪 | AlphaLab SnR, Alpha Omage | -- |
| 在体电生理 | OmniPlex神经记录数据采集系统 | Plexon | -- |
| 高密度柔性神经电极 | NeuroXess | NSDS | |
| 空间转录组 | Visium空间基因表达载玻片与试剂盒 | 10× Genomics | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 类器官构建与诱导分化 | iPSC接种密度（30,000个/孔）、LDN-193189（1 μM）和CHIR99021（3 μM）浓度、RA（0.1 μM）添加时间（第3天）、purmorphamine（1 μM）浓度、LDH–Matrigel中LDH浓度（10 μg/ml）、摇床转速（65 rpm）、BDNF/GDNF浓度（10 ng/ml）及添加时间（第17天） 阅读提示：Methods中“Cell culture and generation of sOrgs”及“Preparation of LDH and LDH-engineered Matrigel”小节 |
| 动物模型与移植 | 小鼠品系（雌性M-NSG）、体重和周龄（20±2 g，7–8周龄）、损伤节段（T9）、横断长度（2 mm）、移植类器官体外培养天数（21天）、每组样本量（n=25）、镇痛方案（布洛芬3 mg/kg） 阅读提示：Methods中“Animal model and organoid transplantation”小节 |
| 行为学评估 | BMS评分观察时间（14周，每周）、步态分析时间（术后14周，每组4只）、水平梯实验时间（7周和14周）、von Frey和热板实验时间（术后3–7周）、热板温度（50°C） 阅读提示：Methods中“Kinematic assessment”和“Sensory behaviour assessment”小节及Fig. 2图注 |
| 电生理与光遗传学验证 | MEA记录类器官培养天数（35天）、膜片钳记录模式与刺激参数（10 pA step，500 ms；ramp −80至+60 mV，1 s）、光遗传病毒注射量（300 nl）和滴度（5.0×10^12 vg/ml）、抑制光参数（590 nm，10 mA，200 s）、在体电生理采样率（40 kHz） 阅读提示：Methods中“Whole-cell membrane clamp electrophysiology”“MEA recording”“Electrophysiological procedures and optogenetics experiments”小节 |
| 空间转录组与数据分析 | ST-seq时间点（移植后7周）、参考数据集（GSE171892、GSE136719、GSE188516）、分析软件（Space Ranger v.3.0、Seurat、Loupe browser 8）及统计方法 阅读提示：Methods中“10× Visium spatial transcriptomics”和“ST-seq data analysis and cell-type annotation”小节 |
