构建iPSC来源WAT与肝脏MPS
建立可灌注的功能性人脂肪和肝脏微组织，用于后续衰老诱导。
将hiPSC分化为脂肪细胞和肝细胞，加载至PDMS芯片细胞腔，以10 μl/h灌注培养。
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人类衰老微生理系统重现体内过程加速抗衰老策略评估
Human microphysiological systems of aging recreate the in vivo process expediting evaluation of anti-geronic strategies
实验完整度
高含iPSC来源脂肪与肝MPS体外模型、异时血清处理、脂肪-肝互联、BONCAT蛋白组、RNA-seq、机器学习年龄预测及药物/ siRNA功能验证
主要模型
人iPSC来源白色脂肪组织微生理系统（iADIPO MPS） 人iPSC来源肝脏微生理系统（iHEP MPS） WAT-肝脏互联微生理系统 年轻/年老供体人血清
重点核对
血清供体年龄与性别：年轻21–34岁，年老>62岁，亚撒哈拉裔健康供体；肝MPS使用5供体混合男性血清 OCM/YCM处理：HPLM+5%人血清灌注4天；部分实验延长至8天或切换血清 WAT-肝脏互联：脂肪与肝细胞比例5:1，单次通过流速20 μl/h，基础HPLM+5% KSR 药物处理：dasatinib 200 nM + quercetin 20 μM（DQ）、ALK5i 342 nM、oxytocin 15 μM、rapamycin 20 nM，处理4天 siRNA敲低：CDKN2A/p16 siRNA 100 nM经Lipofectamine RNAiMAX转染，过夜灌注
摘要
寻找人类衰老的生物学机制因缺乏合适模型而停滞，且啮齿类动物中报道的年轻化是否以及在多大程度上可转化至人类仍未知。本文报道了一种人诱导多能干细胞来源的微生理系统，在异时人血清存在下模拟白色脂肪组织-肝脏轴，以研究人类衰老与年轻化。我们揭示了衰老与年轻化在功能和分子标志上的变化，并研究了人类组织衰老中未知的生物标志物与可塑性机制及潜在年轻化策略。该微生理芯片在4天内重现了人类数十年衰老相关的标志，包括基因表达的老化转变和氧化性DNA损伤。我们发现了人类衰老中未知的信号网络、脂肪衰老对肝脏的级联效应、衰老的性别多态性及年龄的组织记忆，并开发了定制机器学习模型评估生物学年龄。将异时人血清与微生理系统结合，可快速建立人类组织衰老、发现临床相关机制与生物标志物，并测试抗衰老方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用人iPSC来源WAT-肝脏轴微生理系统结合异时人血清，在体外快速重现人类衰老并评估年轻化策略？
- 核心机制
- 年老血清驱动衰老标志与SASP，脂肪衰老通过循环因子级联传播至肝脏；TGFβ/SMAD、mTOR及炎症网络参与调控，组织保留年龄记忆。
- 主要证据
- OCM处理4天诱导WAT和肝MPS衰老、氧化DNA损伤、胰岛素抵抗及脂代谢紊乱；RNA-seq与GTEx人类数据及机器学习年龄预测一致；脂肪-肝互联传播衰老；药物和siRNA干预可部分逆转。
- 研究意义
- 该系统可快速建立人组织衰老、发现临床相关机制与生物标志物，并在高人类相关性的临床前模型中测试抗衰老策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
异时人血清诱导MPS衰老
验证年老血清能否在短期内建立人类衰老标志。
WAT和肝MPS以HPLM+5%年轻或年老供体血清灌注4天，检测衰老、SASP、氧化DNA损伤及代谢功能。
脂肪-肝脏互联传播衰老
验证衰老脂肪能否通过循环因子将衰老传播至肝脏。
WAT MPS先经YCM或OCM预处理建立细胞记忆，再与未处理肝MPS单向互联，以基础HPLM灌注。
BONCAT新合成蛋白组分析
解析OCM与YCM下新合成蛋白及分泌组差异。
MetRSL274G hiPSC来源WAT MPS在YCM/OCM处理时加入ANL标记新合成蛋白，经click化学标记后用人抗体阵列检测。
转录组与人类数据库比对及机器学习年龄预测
评估芯片衰老是否重现人类自然衰老并预测组织年龄。
对血清处理WAT MPS进行bulk RNA-seq，与GTEx等数据库比较GO/KEGG、衰老标志和转录噪声；用GTEx数据训练年龄预测模型并预测MPS年龄。
抗衰老策略药物筛选与siRNA验证
测试衰减或逆转芯片衰老的干预措施。
在OCM同时、OCM后继续或去血清稀释条件下给予DQ、ALK5i、OT、Rapa；并用CDKN2A siRNA敲低验证p16功能。
异时血清切换年轻化验证
验证从年老血清切换至年轻血清能否逆转芯片衰老。
WAT和肝MPS先以OCM灌注4天，再切换YCM灌注4天，与持续OCM对照比较衰老和代谢指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 芯片制备 | SU-8 3100光刻胶 | MicroChem | -- |
| 聚二甲基硅氧烷（Sylgard 184） | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| 活检打孔器 | World Precision Instruments | 504529 | |
| PET等孔膜 | SABEU | 030060 | |
| 双(3-三甲氧基硅基丙基)胺 | Sigma-Aldrich | 413356 | |
| 细胞培养 | ReLeSR细胞解离试剂 | StemCell Technologies | 100-0483 |
| mTeSR Plus培养基 | StemCell Technologies | 100-0276 | |
| 基质胶 | Corning | 356231 | |
| 脂肪分化 | STEMdiff间充质祖细胞试剂盒 | StemCell Technologies | 05240 |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| 罗格列酮 | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| 胰岛素（Humulin R） | Eli Lilly | 0002-8315-01 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D5207 | |
| 肝分化 | 激活素A | StemCell Technologies | 78001 |
| CHIR99201 | StemCell Technologies | 100-1042 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | 100-18B | |
| 骨形态发生蛋白4 | Peprotech | 120-05ET | |
| PI103 | ThermoFisher | 501932056 | |
| 肝细胞生长因子 | Peprotech | 100-39 | |
| 制瘤素M | Peprotech | 300-10 | |
| 肝细胞培养基BulletKit | Lonza | CC-3198 | |
| MPS灌注 | 注射泵 | Harvard Apparatus | 703007 |
| 血清处理 | 人血浆样培养基 | Gibco | A4899101 |
| 药物处理 | 达沙替尼 | Sigma-Aldrich | SML2589 |
| 槲皮素 | Sigma-Aldrich | Q4951 | |
| ALK5抑制剂 | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | |
| 醋酸催产素 | Bachem | 4016373 | |
| 雷帕霉素 | Sigma-Aldrich | R8781 | |
| siRNA转染 | RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher | 13778075 |
| Opti-MEM培养基 | ThermoFisher | 31985070 | |
| 对照siRNA | Cell Signaling Technology | 6568 | |
| CDKN2A/p16 siRNA | Cell Signaling Technology | 6598 | |
| 功能检测 | Bodipy 500/510 C1, C12荧光脂肪酸 | ThermoFisher | D3823 |
| Amplex Red葡萄糖/葡萄糖氧化酶检测试剂盒 | ThermoFisher | A22189 | |
| TNF ELISA试剂盒 | ThermoFisher | KHC3011 | |
| 8-OHdG ELISA试剂盒 | G-Biosciences | IT7974 | |
| P16 ELISA试剂盒 | Abcam | ab227903 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher | 23225 | |
| 免疫荧光 | 抗CDKN2A/p16INK4a抗体 | Abcam | ab108349 |
| Alexa Fluor 647抗兔IgG | ThermoFisher | B40926 | |
| DAPI | ThermoFisher | D1306 | |
| Bodipy 493/503脂肪酸染料 | ThermoFisher | D3923 | |
| β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9860 | |
| BONCAT | Click-iT蛋白反应缓冲液试剂盒 | ThermoFisher | C10276 |
| 人L507抗体阵列 | RayBiotech Life | -- | |
| qPCR | TaqMan通用PCR预混液 | ThermoFisher | 4304437 |
| Maxima第一链cDNA合成试剂盒 | ThermoFisher | K1641 | |
| 成像 | EVOS M5000成像系统 | ThermoFisher | -- |
| LSM710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| LSM900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 异时血清处理 | 血清供体年龄（年轻21–34岁，年老≥62岁）、性别、健康状态及亚撒哈拉裔背景；血清浓度5%；处理4天 阅读提示：Methods中“Old and young circulatory milieu treatment”及Supplementary Table 2 |
| WAT-肝脏互联 | 脂肪:肝细胞比例5:1；单向流速20 μl/h；连接前WAT冲洗条件；基础培养基为HPLM+5% KSR 阅读提示：Methods中“Interconnection of WAT and liver MPS” |
| 药物处理 | DQ（dasatinib 200 nM + quercetin 20 μM）、ALK5i 342 nM、oxytocin 15 μM、rapamycin 20 nM；处理4天；三种给药方案及对照组设置 阅读提示：Methods中“Drug administration”及Fig. 6图注 |
| siRNA敲低 | CDKN2A/p16 siRNA 100 nM；Lipofectamine RNAiMAX用量；过夜灌注；转染起始时间（day 14或day 12） 阅读提示：Methods中“siRNA knockdown in WAT MPS”及Fig. 6d,e图注 |
| 年龄预测模型 | GTEx训练/验证样本比例70%/30%；各性别和脂肪库样本量；高变基因筛选及LDA降维；6个年龄组分类 阅读提示：Methods中“Transcriptome-based age-group prediction model”及Extended Data Fig. 4 |