H. antarcticus 分型基因组组装与注释
获得首个冰鱼物种的单倍型解析染色体水平参考基因组,为后续比较基因组和基因座分析提供基础
使用ONT长读长和Hi-C数据组装H. antarcticus基因组,获得两个高质量单倍型;进行重复元件注释、基因注释、端粒和rDNA注释;评估组装完整性和杂合度
A new phased assembly of the Antarctic spiny plunderfish provides novel insights into the evolution of the notothenioid radiation
包含新分型基因组组装、跨12种冰鱼比较基因组分析、afgp基因座单倍型解析、选择分析和重复元件分析等多个独立证据层级,并进行了机制层面的验证分析。
Harpagifer antarcticus 分型基因组组装 12种冰鱼染色体水平基因组 H. antarcticus 鳃组织RNAseq样本
H. antarcticus 基因组组装使用ONT长读长和Hi-C数据,两个单倍型总长度分别为1,069 Mb和1,222 Mb,BUSCO完整性99% afgp基因座位于16号染色体,Hap1和Hap2分别注释到17和16个afgp基因拷贝,以及各2个嵌合afgp/tlp基因 比较基因组分析使用12种冰鱼染色体水平基因组,包括新组装的H. antarcticus Hap1和11个公开组装 选择分析使用扩展数据集,额外加入7种温带或热带鱼类,测试冰鱼祖先分支上的多样化选择 LINE-L2分析基于Hap1和Hap2中长度大于1,000 bp的LINE-L2插入,提取逆转录酶结构域序列进行系统发育分析
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得首个冰鱼物种的单倍型解析染色体水平参考基因组,为后续比较基因组和基因座分析提供基础
使用ONT长读长和Hi-C数据组装H. antarcticus基因组,获得两个高质量单倍型;进行重复元件注释、基因注释、端粒和rDNA注释;评估组装完整性和杂合度
表征H. antarcticus基因组中转座子组成、活性历史以及LINE-L2家族的演化动态
使用RepeatModeler和RepeatMasker注释重复元件;提取LINE-L2逆转录酶结构域进行系统发育分析,鉴定高拷贝家族;重建家族共识序列并在12种冰鱼基因组中搜索;通过CpG校正的Kimura距离转换为绝对时间构建重复景观
评估H. antarcticus两个单倍型之间的序列和结构差异,识别近期活跃的转座子插入
使用Minimap2和Syri进行全基因组比对,鉴定SNP、结构变异和重排;使用GLMM分析SV与基因组特征的关联;通过ONT reads回贴和Sniffles2检测杂合SV;重叠RepeatMasker注释识别杂合TE插入
解析afgp基因座在H. antarcticus两个单倍型上的结构、基因拷贝数和演化历史
使用GeMoMa和BLASTN进行同源基因预测和手动注释;使用Klumpy验证注释完整性;基于exon-1和intron-1构建afgp和嵌合afgp/tlp基因的最大似然树;在多个冰鱼物种中自动注释afgp基因座
重建冰鱼物种树和分化时间,量化基因组获得和丢失,分析共线性关系和染色体融合
使用12种冰鱼染色体水平基因组和7种温带/热带鱼类;提取单拷贝BUSCO基因进行系统发育分析;使用LSD2进行时间校准;使用GENESPACE和Progressive Cactus进行共线性分析和全基因组比对;使用HAL推断插入和缺失事件
鉴定冰鱼祖先分支上经历多样化选择的蛋白编码基因和新出现的保守非编码元件
使用OrthoFinder聚类直系同源组,DISCO分解多拷贝OG;使用PRANK进行密码子比对;使用aBSREL检测多样化选择;使用PhastCons预测保守元件;使用halAlignmentDepth确定CEs的起源;进行GO富集分析
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取和质量评估 | Qubit 1X dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | ThermoFisher | Q33231 |
| Qubit Flex荧光计 | ThermoFisher | Q33327 | |
| DNA质量评估 | Femto Pulse脉冲场电泳系统 | Agilent | M5330AA |
| gDNA 165 kb分析试剂盒 | Agilent | FP-1002-0275 | |
| ONT测序文库构建 | 连接法测序试剂盒V14 | -- | SQK-LSK114 |
| RNAseq文库构建 | Kapa Hyperprep UDI文库构建试剂盒 | Kapa | KK8544 |
| 细胞培养 | 无酚红L15培养基 | -- | -- |
| Nunclon组织培养板 | Nunclon | -- | |
| RNA提取 | TRI试剂 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因组组装 | ONT reads覆盖度约23.4X每单倍型;Hifiasm版本0.24.0-r702,使用--ont选项和Hi-C定相模式;Hi-C数据使用bwa-mem2比对,YaHS进行scaffolding 阅读提示:Methods中Genome assembly小节 |
| RNAseq样本处理 | 三只H. antarcticus标本的鳃组织,在0°C和6°C分别孵育6天;每个温度一个样本;RNA提取使用TRI Reagent;1 µg rRNA depleted RNA用于文库构建;Novaseq PE150测序 阅读提示:Methods中Sequencing data generation小节 |
| 重复元件注释 | RepeatModeler v.2.0.5使用-LTRStruct扩展;ProtExcluder v.1.2去除宿主基因;MCHelper v1.7.0默认参数;RepeatMasker sensitive模式 阅读提示:Methods中Repeat annotation小节 |
| afgp基因座注释 | 使用D. mawsoni afgp基因座(accession HQ447059.1,haplotype 1)作为参考;GeMoMa v1.7.1默认参数;BLASTN v2.12.0手动注释;Klumpy验证;afgp基因座位于16号染色体约699 kb 阅读提示:Methods中Annotation of the afgp locus小节 |
| 比较基因组分析 | 使用12种冰鱼染色体水平基因组和7种温带/热带鱼类;单拷贝BUSCO基因使用MAFFT E-INS-i比对;TrimAl automated模式清理;1,000个比对随机选择;IQ-TREE v2.4.0约束树搜索;LSD2使用固定替换率进行时间校准,校准点:94 MYA、47 MYA、10.7 MYA 阅读提示:Methods中Species tree reconstruction and divergence time estimation小节 |
| 选择分析 | OrthoFinder v2.5.4 ultra-sensitive模式聚类;DISCO分解多拷贝OG;PRANK v250331密码子模型比对;Gblocks和TrimAl过滤;OG比对长度>300密码子;aBSREL from HyPhy v2.5.8测试冰鱼祖先分支;排除在温带适应分支受选择的基因 阅读提示:Methods中Selection analyses小节 |
| 单倍型变异分析 | Minimap2 v2.26全基因组比对;Syri v1.7.1检测SNP、SV和重排;GLMM使用lme4包,染色体为随机截距;ONT reads回贴使用Minimap2,Sniffles2检测杂合SV;SURVIVOR合并SV 阅读提示:Methods中Haplotype comparison小节 |