Cry1Δ11小鼠重复行为表型评估
验证Cry1Δ11突变是否导致重复行为。
在ZT14-16进行开放圆柱体测试，录像10分钟，离线盲法评分自我梳理、站立和挖掘行为。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
背外侧纹状体DRD1-MSNs活动增强是Cry1Δ11突变诱导重复行为的基础
Increased activity of DRD1-MSNs in dorsolateral striatum underlies Cry1Δ11 mutation-induced repetitive behaviors
实验完整度
高包含体外电生理、免疫荧光、Western blot、在体光纤钙成像、化学遗传学操控及药物干预等多层级功能与机制验证。
主要模型
Cry1Δ11敲入小鼠与野生型同窝对照 DRD1-Cre+/Cry1Δ11与DRD1-Cre+/WT小鼠 背外侧纹状体DRD1-MSNs SNr投射标记的推定DRD1-MSNs
重点核对
行为测试在ZT14-16进行，采用开放圆柱体测试评估自我梳理、站立和挖掘行为，n=7 WT对7 Cry1Δ11 光纤钙成像在DLS注射rAAV-hSyn-DIO-GCaMP6s，记录自发自我梳理和站立期间的钙信号，n=3小鼠每组 化学遗传学抑制使用rAAV2/8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-eGFP，CNO 1 mg/kg i.p.，注射后30 min测试，n=13 WT对12 Cry1Δ11 化学遗传学激活使用rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-eGFP，CNO 1 mg/kg i.p.，注射后30 min测试，n=7 vehicle对8 CNO SCH23390在电生理中10 μM灌流，在行为中15 μg/kg i.p.，注射后30 min测试，n=7 WT对7 Cry1Δ11
摘要
重复行为通常与自闭症谱系障碍和强迫症相关，但也显著出现于注意力缺陷多动障碍（ADHD）中，然而其潜在机制仍知之甚少。我们最近的工作在Cry1Δ11小鼠中发现了ADHD样行为，其中核心昼夜节律基因Cry1的突变产生CRY1Δ11蛋白，该蛋白无法抑制Gαs亚基，导致多巴胺D1受体（DRD1）信号过度活跃。尽管这种失调最初在腹侧纹状体中被报道，但我们假设类似机制可能存在于背侧纹状体中，该脑区关键参与重复行为的产生，并且密集分布着表达DRD1的中型多棘神经元（MSNs）。在此，我们证明Cry1Δ11小鼠表现出强烈的重复行为，包括过度自我梳理和刻板性站立，这与背外侧纹状体中DRD1-MSNs活动增加相关。化学遗传学操作进一步揭示，激活这些神经元会诱导过度自我梳理，而抑制它们则减少这种行为，表明对重复动作的双向控制。关键的是，全身给予DRD1拮抗剂SCH23390完全挽救了突变小鼠的神经元过度活跃和行为异常。总之，我们的发现建立了核心昼夜节律基因突变、纹状体多巴胺能过度活跃和重复行为之间的直接机制联系，从而将背外侧纹状体中异常的DRD1信号确定为治疗干预的有前景靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Cry1Δ11突变是否通过背侧纹状体DRD1信号过度活跃导致ADHD相关的重复行为，以及DRD1-MSNs活动是否必要且充分。
- 核心机制
- CRY1Δ11突变破坏CRY1对Gαs的抑制，导致背外侧纹状体DRD1-MSNs中cAMP/PKA信号增强、c-Fos和p-CREB上调及神经元过度活跃，进而驱动重复行为。
- 主要证据
- Cry1Δ11小鼠在开放圆柱体测试中自我梳理和站立增加；DLS中c-Fos+/DRD1+神经元和c-Fos、p-CREB蛋白上调；电生理显示RMP去极化；光纤钙成像显示梳理时DLS DRD1-MSNs钙信号增强；化学遗传学抑制减少梳理、激活诱导梳理；SCH23390挽救RMP和行为。
- 研究意义
- 建立了核心昼夜节律基因突变、纹状体多巴胺能过度活跃与重复行为之间的直接机制联系，并将背外侧纹状体异常的DRD1信号确定为治疗干预的有前景靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
背侧纹状体DRD1信号通路激活检测
评估Cry1Δ11小鼠背侧纹状体中DRD1信号通路是否过度激活。
免疫荧光染色检测c-Fos与DRD1共定位，Western blot检测c-Fos和p-CREB蛋白水平。
背侧纹状体DRD1-MSNs电生理特性记录
确定DRD1信号增强是否导致神经元兴奋性增加。
向SNr注射红色荧光逆行珠标记投射神经元，制备含背侧纹状体的冠状脑片，进行全细胞膜片钳记录RMP、Rin、F-I曲线、mEPSC和mIPSC。
在体光纤钙成像监测DLS DRD1-MSNs活动
探究DRD1-MSNs是否在重复行为期间被功能招募。
将Cry1Δ11小鼠与DRD1-Cre小鼠杂交，在DLS单侧注射Cre依赖的rAAV-hSyn-DIO-GCaMP6s，植入光纤，记录自发自我梳理和站立期间的钙信号。
化学遗传学双向操控DLS DRD1-MSNs
建立DLS DRD1-MSNs活动对重复行为的必要性和充分性。
在DRD1-Cre+/Cry1Δ11和DRD1-Cre+/WT小鼠DLS双侧注射抑制性DREADD rAAV2/8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-eGFP，或在DRD1-Cre+/WT小鼠注射兴奋性DREADD rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-eGFP，三周后给予CNO或生理盐水，30分钟后测试行为。
DRD1拮抗剂SCH23390药理学挽救
测试抑制DRD1信号能否挽救神经元过度活跃和重复行为。
脑片灌流SCH23390 (10 μM)记录RMP；全身给予SCH23390 (15 μg/kg, i.p.) 30分钟后进行行为测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证电生理特性
验证在体神经元活动
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 行为测试 | SCH23390 | Selleck | -- |
| 化学遗传学 | 氯氮平N-氧化物 | Selleck | -- |
| Western blot | c-Fos抗体 | Synaptic Systems | P12841 |
| CREB抗体 | Cell Signaling Technology | 9197 | |
| 磷酸化CREB抗体 | Cell Signaling Technology | 9198 | |
| β-ACTIN抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| Pierce ECL蛋白质印迹底物试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| 免疫荧光 | c-Fos抗体 | SYSY | P12841 |
| DRD1抗体 | Sigma-Aldrich | D2944 | |
| 光纤钙成像 | AAV2/9-hSyn-DIO-GCaMP6s-WPREs | Taitool | -- |
| 化学遗传学 | rAAV2/8-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-eGFP-WPRE-pA | Taitool | -- |
| rAAV2/8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-eGFP-WPRE-pA | Taitool | -- | |
| 电生理 | 红色荧光逆行珠 | Lumafluor | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 行为测试 | 小鼠基因型、年龄8-12周、雄性、ZT14-16测试、开放圆柱体规格、录像时长10分钟、行为评分盲法、清洗用30%乙醇、样本量WT n=7和Cry1Δ11 n=7 阅读提示：Methods中Behavioral tests小节及Fig. 1图注 |
| 光纤钙成像 | 病毒类型AAV2/9-hSyn-DIO-GCaMP6s、滴度1.0×10^13 vg/mL、注射体积0.3 μL、速率30 nL/min、光纤规格200-μm NA 0.37、植入深度300 μm、术后3-4周记录、激发光470 nm功率~30 µW、n=3小鼠 阅读提示：Methods中Stereotaxic surgery and viral injections及Fiber photometry and analysis小节，Fig. 4图注 |
| 化学遗传学操控 | DREADD病毒类型、滴度、注射体积、CNO剂量1 mg/kg、给药途径i.p.、注射后30分钟测试、抑制组n=13 WT对12 Cry1Δ11、激活组n=7 vehicle对8 CNO 阅读提示：Methods中Behavioral tests及Stereotaxic surgery and viral injections小节，Fig. 5图注 |
| 电生理记录 | 脑片厚度300 μm、ACSF成分、记录温度34-35°C、电极内液成分、mEPSC记录加TTX 1 μM和PTX 50 μM、mIPSC记录加TTX 1 μM和KYN 1.5 mM、钳制电压-70 mV、串联电阻<20 MΩ、样本量 阅读提示：Methods中Electrophysiological recording and analysis小节，Fig. 3图注 |
| 药理学挽救实验 | SCH23390剂量15 μg/kg、给药途径i.p.、注射后30分钟测试、电生理中浓度10 μM、样本量WT n=7和Cry1Δ11 n=7 阅读提示：Methods中Behavioral tests小节，Fig. 6图注 |