3D HepaRG球体培养
建立代谢活跃的3D肝细胞模型用于遗传毒性测试
HepaRG细胞在2D培养中分化14天后，胰蛋白酶消化并接种于96-well ULA板形成球体，每2天更换无DMSO新鲜培养基，1周后用于化学物暴露。
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推进遗传毒性评估：从二维到三维HepaRG球体模型的转录组生物标志物
Advancing genotoxicity assessment with transcriptomic biomarkers: From 2D to 3D HepaRG spheroid models
实验完整度
中采用3D HepaRG球体模型，TempO-Seq检测基因表达，GENOMARK和TGx-DDI分类，但仅体外单一模型，缺乏独立体内验证。
主要模型
3D HepaRG球体模型 2D HepaRG细胞（用于GENOMARK和TGx-DDI标志物开发） TK-6细胞（用于TGx-DDI标志物开发）
重点核对
HepaRG细胞系来源：Biopredic International（Rennes, France），使用passages 15至18 3D球体接种密度：2,000 cells/well于96-well ultra-low attachment (ULA) Plates 化学物处理浓度：IC10和IC10/2，部分化合物有额外浓度（如B[a]P和AFB2测试3个浓度，TPA额外5 µM） 处理时间：72小时重复给药，每24小时更换培养基 每个条件收集32个球体用于RNA裂解液制备，独立重复3次使用不同HepaRG细胞批次
摘要
需要开发新方法学（NAMs）用于遗传毒性测试，以支持向无动物、与人相关的化学遗传毒性评估过渡。在此背景下，我们研究了在2D细胞系统中开发的两种转录组生物标志物（GENOMARK和TGx-DDI）在代谢活跃的3D HepaRG球体中对化学物进行遗传毒性（GTx）或非遗传毒性（NGTx）分类的预测能力。人肝HepaRG球体用三组不同化学物处理72小时：（i）五种遗传毒性化学物：Lasiocarpine、cyclophosphamide、ethyl methanesulfonate、aflatoxin B1、benzo[a]pyrene；（ii）五种非遗传毒性非致癌物：Aflatoxin B2、2-deoxy-D-glucose、D-mannitol、caffeine、ampicillin trihydrate；（iii）五种非遗传毒性致癌物：Perfluorooctanoic acid、diethanolamine、thioacetamide、phorbol-12-myristate-13-acetate、di(2-ethylhexyl) phthalate。使用高通量TempO-Seq技术收集处理后的HepaRG球体的基因表达数据，并用转录组生物标志物GENOMARK和TGx-DDI进行分析。两种生物标志物的结果通常与所有三组测试化学物的现有知识一致，有效区分了遗传毒性和非遗传毒性化学物。本研究结果表明，将3D HepaRG球体模型与转录组生物标志物相结合，为补充传统体外遗传毒性测试提供了一种有前景的、与人相关的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在代谢活跃的3D HepaRG球体模型中，2D细胞系统开发的转录组生物标志物GENOMARK和TGx-DDI能否准确分类化学物的遗传毒性？
- 核心机制
- GENOMARK和TGx-DDI通过分析化学物诱导的特定基因集表达谱，利用机器学习方法评估DNA损伤，从而区分遗传毒性和非遗传毒性化学物。
- 主要证据
- 3D HepaRG球体经15种化学物处理72小时后，TempO-Seq检测基因表达，GENOMARK和TGx-DDI分类结果显示两种标志物联合准确分类13/15种化学物（86.7%），所有GTx化学物均被正确分类，NGTxC组大多为阴性。
- 研究意义
- 将3D HepaRG球体模型与转录组生物标志物结合，为补充传统体外遗传毒性测试提供了一种有前景的、与人相关的方法，并可能增强对化学物诱导遗传毒性的机制理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
化学物选择与浓度确定
确定非毒性浓度以进行转录组实验，避免假阳性
选择15种化学物（5 GTx, 5 non-GTx, 5 NGTxC），进行预细胞毒性试验确定IC10和IC10/2浓度，部分化合物根据预试验结果增加额外浓度。
细胞毒性评估
确保所选浓度不引起严重细胞毒性
使用CellTiter-Glo 3D Cell Viability kit评估ATP发光，计算相对细胞活力，确定IC10、IC50和IC90值。
RNA裂解液制备与TempO-Seq测序
获取化学物处理后的基因表达谱
每个条件收集32个球体，用BioSpyder Enhanced 2X Lysis Buffer裂解，制备RNA裂解液，使用TempO-Seq Human whole transcriptome (v2.1) probe set和试剂盒构建文库，Illumina NextSeq 2000测序。
转录组生物标志物分类
使用GENOMARK和TGx-DDI对化学物进行遗传毒性分类
TempO-Seq数据经log2转换后，使用GENOMARK的SVM和Random Forest算法及TGx-DDI的Nearest Shrunken Centroids方法计算预测分数，根据阈值分类为阳性、阴性或不确定。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Williams E培养基1X + Glutamax-I | Gibco | -- |
| 胎牛血清FetalClone II | Cytiva | -- | |
| 青霉素5,000单位/mL/链霉素5,000 µg/mL | Gibco | -- | |
| 胰岛素 | Sigma | -- | |
| 氢化可的松半琥珀酸酯 | Upjohn | -- | |
| TryplE 1X | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 3D球体培养 | 96孔超低吸附板 | Sigma | -- |
| 化学物处理 | DMSO | Sigma | -- |
| 细胞毒性测定 | CellTiter-Glo 3D细胞活力试剂盒 | Promega | -- |
| FLUOstar Optima酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| RNA裂解液制备 | BioSpyder Enhanced 2X裂解缓冲液 | BioSpyder | P/N 201247 |
| RNA测序 | TempO-seq人全转录组试剂盒 | BioSpyder | -- |
| Illumina NextSeq 2000测序系统 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism | GraphPad | -- |
| R软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D HepaRG球体培养 | HepaRG细胞系来源、传代次数、分化条件（1.7% DMSO 14天）、接种密度（2,000 cells/well）、培养基成分、球体形成时间（1周） 阅读提示：查看Materials and methods中HepaRG cell culture和HepaRG in a 3D culture system小节，以及Fig. 1 |
| 化学物处理 | 化学物浓度（IC10和IC10/2，部分化合物有额外浓度）、处理时间（72小时重复给药）、溶剂（1% DMSO）、无血清培养基 阅读提示：查看Materials and methods中Chemical exposure小节和Table 1 |
| 细胞毒性评估 | 使用CellTiter-Glo 3D试剂盒、每个条件1个球体、ATP发光检测、生物学重复数（3次独立实验） 阅读提示：查看Materials and methods中Cell viability assay小节和Fig. 2 |
| RNA裂解液制备和TempO-Seq | 每个条件32个球体、裂解缓冲液（BioSpyder Enhanced 2X Lysis Buffer）、TempO-Seq Human whole transcriptome (v2.1) probe set、测序平台（Illumina NextSeq 2000） 阅读提示：查看Materials and methods中RNA lysate preparation和TempO-Seq assay小节 |
| 转录组生物标志物分类 | GENOMARK的SVM和RF算法、TGx-DDI的NSC方法、预测分数阈值（>0.55阳性，<0.45阴性，0.45-0.55不确定）、分类规则 阅读提示：查看Materials and methods中Transcriptomic biomarker-based chemical classification小节和Table 2 |