肿瘤相关髓系细胞中CysLTR1表达筛选与验证
确定肿瘤相关髓系细胞中差异表达且与应急髓系生成相关的受体。
分析GSE21927、GSE39807、GSE223028等数据集，并用qPCR和流式验证Cysltr1在肿瘤浸润CD11b+Gr1+细胞及Ly6G+中性粒细胞中的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向半胱氨酰白三烯受体1重编程促肿瘤髓系生成并克服免疫检查点治疗耐药
Targeting cysteinyl leukotriene receptor 1 reprograms tumor-promoting myelopoiesis and overcomes immune checkpoint therapy resistance
实验完整度
高包含体外分化、RNA-seq/ATAC-seq/scRNA-seq、多种小鼠肿瘤模型及患者PBMC与TNBC组织验证，并有机制和功能验证。
主要模型
Cysltr1−/−与Cysltr1+/+小鼠骨髓来源GM-CSF/IL-6诱导中性粒细胞 EMT6、E0771、MC38、LLC1、BPS1、CT26、YUMMER1.7等小鼠肿瘤模型 Cysltr1f/fLyz2-cre与骨髓移植嵌合体小鼠 人PBMC及卵巢癌患者PBMC诱导中性粒细胞
重点核对
CysLTR1缺失或MTK处理对肿瘤生长及生存期的影响 中性粒细胞Ly6G+/Ly6C+比例及PMN-MDSC抑制T细胞增殖能力 MXD1和NFE2对Elane、Mpo、S100a8、S100a9等颗粒基因的调控 STAT3结合Cysltr1启动子及AKT/ERK通路激活 MTK联合anti-PD-1在多种小鼠肿瘤模型中的疗效
摘要
“应急”髓系生成通常发生以促进恶性肿瘤进展。免疫抑制性中性粒细胞，也被称为PMN-MDSC（多形核髓源性抑制细胞），是免疫抑制和促肿瘤的强效介质。在这里，我们证明CysLTR1（半胱氨酰白三烯受体1，哮喘和其他炎症疾病的关键参与者）的STAT3依赖性诱导维持了促肿瘤应急髓系生成。CysLTR1的基因消融和药理抑制可增强抗肿瘤免疫从而抑制肿瘤生长。CysLTR1抑制的抗肿瘤效应与粒细胞生成的转录组重编程和中性粒细胞重编程为抗肿瘤免疫表型相关；这一过程需要不同的转录因子MXD1和NFE2来特异性决定髓系祖细胞定向和分化，并与颗粒货物的受控从头合成相关。使用临床可用拮抗剂靶向CysLTR1可克服多种小鼠肿瘤模型中对anti-PD-1的耐药性。因此，这些发现为CysLTR1抑制剂靶向应急粒细胞生成及其快速转化提供了机会，并揭示了一种新的程序化“解除武装”中性粒细胞策略以改善癌症免疫治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CysLTR1是否调控肿瘤相关应急髓系生成、中性粒细胞功能编程及免疫检查点治疗耐药。
- 核心机制
- 肿瘤来源GM-CSF和IL-6激活STAT3并上调CysLTR1，CysLTR1经AKT/ERK及MXD1/NFE2调控中性粒细胞颗粒合成与促肿瘤分化。
- 主要证据
- CysLTR1基因消融或MTK抑制减少Ly6G+中性粒细胞、降低颗粒蛋白、增强CD8+ T细胞免疫并抑制肿瘤生长；RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-qPCR、scRNA-seq及BM嵌合体支持机制。
- 研究意义
- 研究提出靶向CysLTR1重编程应急粒细胞生成并“解除”中性粒细胞促肿瘤功能，可改善癌症免疫治疗，并为联合anti-PD-(L)1提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CysLTR1缺失或抑制对应急髓系生成和肿瘤进展的影响
验证CysLTR1在肿瘤诱导的髓系生成和肿瘤生长中的作用。
使用Cysltr1−/−、Cysltr1f/fLyz2-cre、MTK处理及骨髓移植小鼠，检测BM、脾和肿瘤中LSK、HPC、CMP、GMP、MEP及中性粒细胞成熟阶段，并记录肿瘤生长和生存。
CysLTR1对中性粒细胞免疫抑制及抗肿瘤T细胞免疫的调控
验证CysLTR1是否影响PMN-MDSC抑制功能和CD8+ T细胞依赖性抗肿瘤免疫。
检测肿瘤浸润T细胞亚群、Treg、耗竭标志物、T细胞抑制实验、抗原呈递标志物、ELISPOT及CD8清除实验。
CysLTR1调控中性粒细胞颗粒合成的转录组与表观遗传分析
解析CysLTR1下游调控中性粒细胞颗粒基因表达的分子机制。
对GM-CSF、GM-CSF+IL-6或GM-CSF+EMT6条件培养基诱导的BM来源CD11b+Gr1+细胞进行bulk RNA-seq和ATAC-seq，并用qPCR、Western blot和ChIP-qPCR验证MXD1/NFE2及颗粒基因。
单细胞转录组解析CysLTR1介导的粒细胞分化模块
在单细胞水平识别中性粒细胞分化轨迹、颗粒程序和转录调控模块。
对EMT6荷瘤Cysltr1+/+和Cysltr1−/−小鼠BM、脾和肿瘤CD45+细胞进行scRNA-seq，分析UMAP聚类、Monocle轨迹、granule score和regulon。
STAT3及AKT/ERK通路对CysLTR1和颗粒基因的调控验证
明确上游细胞因子-STAT3与下游AKT/ERK如何调控CysLTR1及颗粒合成。
检测p-AKT、p-ERK1/2、pSTAT3、CSF2RA，使用AKTi、ERKi、WP1066及GM-CSF/IL-6中和抗体，并进行ChIP-qPCR检测STAT3结合Cysltr1启动子。
人源样本与公共数据验证CysLTR1-MXD1/NFE2轴及临床相关性
验证小鼠机制在人类中性粒细胞和癌症患者中的保守性及临床关联。
使用健康供者和卵巢癌患者PBMC诱导中性粒细胞，进行CYSLTR1、MXD1或NFE2敲低，检测分化、MPO、S100A8/9和T细胞抑制；分析TCGA、METABRIC、GSE78220、phs000452等数据集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | -- | -- |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MEM非必需氨基酸溶液 | Gibco | -- | |
| Matrigel基质胶 | -- | -- | |
| 药物处理 | 孟鲁司特 | -- | -- |
| 齐留通 | -- | -- | |
| WP1066 | -- | -- | |
| 多西环素 | -- | -- | |
| 流式分析 | 抗MPO抗体 | Bio-Rad | 0400-0002 |
| ELISA | 抗DNA抗体 | Sigma-Aldrich | 11544675001 |
| ABTS底物 | Sigma-Aldrich | 10102946001 | |
| S100a8/9 ELISA试剂盒 | eBioscience | -- | |
| 半胱氨酰白三烯ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | -- | |
| G-CSF ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| GM-CSF ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| CitH3 ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| qPCR | SYBR Green | Bio-Rad | -- |
| RNA-seq建库 | Direct-zol RNA小量提取试剂盒 | Zymo Research | -- |
| NEBNext Poly(A) mRNA磁分离模块 | NEB | -- | |
| Ultra II RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| 流式分析 | BD LSR II分析仪 | BD | -- |
| 流式分选 | BD FACS Aria II分选仪 | BD | -- |
| 流式分析 | Live/Dead可固定UV/Yellow/Red染料 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型与处理 | 肿瘤细胞接种数量、途径、小鼠品系、MTK剂量10 mg/kg每日、anti-PD-1 150 μg每鼠每3天、分组和样本量 阅读提示：Methods中Tumor challenge and treatments；Figure 2、Figure 3相关图注 |
| CysLtr1缺失或髓系特异性敲除 | Cysltr1−/−品系、Cysltr1f/fLyz2-cre构建、骨髓移植照射剂量10 Gy和供体细胞1×10^7 阅读提示：Methods中Experimental animals和BM reconstitution；Supplementary Fig. 1、Supplementary Fig. 3 |
| 体外中性粒细胞诱导 | BM细胞来源、GM-CSF 40 ng/ml、IL-6 40 ng/ml、条件培养基1:1、MTK 20 μM、诱导4至5天 阅读提示：Methods中In vitro induction of neutrophils by proinflammatory cytokines |
| T细胞抑制和抗原呈递实验 | CD8+ T细胞来源与标记、anti-CD3/CD28刺激、E:T比例1:1、共培养3天、OTI共培养体系 阅读提示：Methods中T cell-suppression assay & priming assay；Figure 3图注 |
| 机制验证实验 | bulk RNA-seq和ATAC-seq诱导条件、ChIP-qPCR抗体与靶基因、AKTi/ERKi/WP1066处理浓度未明确说明 阅读提示：Methods中Bulk RNA seq analysis、Single-cell RNA library preparation；Figure 4、Figure 7图注 |