OTM模型与scRNA-seq分析
探究正畸力是否诱导PDL成纤维细胞糖酵解相关基因表达变化
建立小鼠OTM模型，分离牙周组织（去除牙龈）进行scRNA-seq，比较CON与OTM组PDL成纤维细胞差异基因及GO富集
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机械载荷下牙周膜成纤维细胞中H3K18la调控免疫微环境与牙槽骨改建
H3K18la in periodontal ligament fibroblasts regulates immune niches and alveolar bone remodeling under mechanical loads
实验完整度
高包含scRNA-seq、CUT&Tag、体外拉伸模型、BMDM共培养、Cxcr2 KO小鼠及微CT等多层级功能与机制验证
主要模型
人牙周膜成纤维细胞 小鼠牙周膜成纤维细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） Cxcr2–/–小鼠OTM模型
重点核对
人PDL成纤维细胞cyclic stretch：10%振幅，0.5 Hz，最长24 h 3PO处理：10 μmol/L预处理2 h后拉伸 BMDMs处理：IL-4 20 ng/mL，CXCL1 10 ng/mL，SB225002 50 nmol/L预处理2 h 小鼠OTM模型：8周龄雄性，镍钛弹簧20 g，7天 牙周注射3PO：5 μL 2 mmol/L，每日一次共7次
摘要
牙槽骨的代谢和改建高度活跃，能够动态响应机械力。然而，牙槽骨如何响应机械力的机制仍不清楚。正畸本质上是一个机械力驱动的牙槽骨改建生理过程。在本研究中，我们证明正畸张力促进了牙周膜（PDL）成纤维细胞中糖酵解相关基因的表达。机械激活的糖酵解随后增强了PDL成纤维细胞中组蛋白H3第18位赖氨酸的乳酸化（H3K18la）。CUT&Tag分析显示，H3K18la富集于CXCL1的启动子区域，从而上调其转录。3PO抑制糖酵解，减弱了PDL成纤维细胞中拉伸力诱导的H3K18la和CXCL1水平。CXCL1随后增强了巨噬细胞的氧化磷酸化，并促进M2巨噬细胞极化。此外，体内通过牙周注射3PO抑制糖酵解，破坏了CXCL1介导的CXCR2+巨噬细胞浸润，并抑制了正畸牙齿移动过程中的骨形成。此外，使用Cxcr2敲除（Cxcr2–/–）小鼠体内阻断CXCL1/CXCR2轴，损害了PDL中张力诱导的M2巨噬细胞极化，破坏了有利于正畸牙齿移动过程中骨形成的促消退微环境。总体而言，这些结果揭示了PDL成纤维细胞中张力诱导的糖酵解–H3K18la轴在创造促消退牙周免疫微环境和促进正畸牙齿移动过程中牙槽骨形成方面发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 正畸机械力如何通过PDL成纤维细胞调控牙周免疫微环境和牙槽骨改建？
- 核心机制
- 张力激活PDL成纤维细胞糖酵解，增加乳酸化修饰H3K18la，促进CXCL1转录与分泌；CXCL1通过CXCR2增强巨噬细胞氧化磷酸化并促进M2极化，形成促消退免疫微环境以利骨形成。
- 主要证据
- scRNA-seq显示OTM组PDL成纤维细胞糖酵解基因富集；CUT&Tag显示H3K18la富集于CXCL1启动子；3PO抑制H3K18la和CXCL1；CXCL1促进BMDMs M2标志物CD206及OCR；Cxcr2 KO小鼠OTM骨沉积减少、M2减少、OCN减少、TRAP增加。
- 研究意义
- 揭示正畸力诱导的代谢–表观遗传轴调控免疫微环境和骨形成，为开发促进牙槽骨再生的治疗策略提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外拉伸力加载
验证张力是否激活人PDL成纤维细胞糖酵解及乳酸化
人PDL成纤维细胞接受cyclic stretch，检测glycoPER、糖酵解酶表达、乳酸水平、Pan Kla、H3K18la、H3K9la水平
CUT&Tag分析H3K18la靶基因
鉴定H3K18la在拉伸处理PDL成纤维细胞中的靶基因
使用anti-H3K18la抗体进行CUT&Tag，分析H3K18la结合峰、KEGG通路及启动子富集，qRT-PCR验证CXCL1等趋化因子
3PO抑制糖酵解及乳酸化
验证糖酵解–H3K18la轴对CXCL1表达的调控
人PDL成纤维细胞拉伸前用3PO预处理，检测Pan Kla、H3K18la、CXCL1蛋白及分泌；外源乳酸处理检测CXCL1和H3K18la
PDL成纤维细胞与BMDMs共培养
验证PDL成纤维细胞来源CXCL1通过CXCR2调控巨噬细胞极化
小鼠PDL成纤维细胞拉伸后与BMDMs共培养，流式检测CD206/F4/80；SB225002预处理BMDMs；RNA-seq分析BMDMs线粒体氧化磷酸化基因；Seahorse检测OCR；ATP检测
体内3PO注射及Cxcr2 KO验证
在体内验证糖酵解–H3K18la–CXCL1/CXCR2轴对骨改建和免疫微环境的作用
OTM小鼠牙周注射3PO，micro-CT分析骨参数，免疫荧光检测H3K18la、CXCL1、OCN、F4/80、CXCR2；Cxcr2 KO小鼠OTM模型分析骨沉积、M2巨噬细胞、OCN+细胞及TRAP+破骨细胞
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | MGISEQ-SEQ系列平台 | MGI | -- |
| 细胞培养 | α-改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素–链霉素 | Life Technologies | -- | |
| 组织消化 | I型胶原酶 | Gibco | -- |
| II型胶原酶 | Gibco | -- | |
| P型胶原酶 | Sigma | -- | |
| 机械力加载 | Flexcell 5000拉伸系统 | Flexcell | -- |
| CUT&Tag | NovoNGS CUT&Tag 4.0高灵敏度试剂盒 | Vazyme | N259-YH01 |
| 抗H3K18la抗体 | PTMBIO | PTM-1427RM | |
| ELISA | CXCL1酶联免疫吸附测定试剂盒 | CLOUD-CLONE CORP. | USEA041Hu |
| BMDMs培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- |
| BMDMs处理 | 白细胞介素-4 | Peprotech | -- |
| C-X-C基序趋化因子配体1 | Peprotech | -- | |
| Seahorse糖酵解速率测定 | 糖酵解速率测定试剂盒 | Seahorse Biosciences | 103344 |
| Seahorse线粒体压力测试 | 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Seahorse Biosciences | 103015 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| qRT-PCR | SYBR Green PCR预混液试剂盒 | Takara | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 抗PKM2抗体 | HUABIO | R1603-5 | |
| 抗PFKFB3抗体 | HUABIO | ET1705-66 | |
| 抗PFKM抗体 | HUABIO | ET7106-97 | |
| 抗泛乳酸化抗体 | PTMBIO | PTM-1401RM | |
| 抗H3抗体 | HUABIO | ET1701-64 | |
| 抗CXCL1抗体 | Thermofisher | PA5-86508 | |
| 免疫荧光/免疫组化 | 抗OCN抗体 | HUABIO | ER1919-20 |
| TRAP染色 | TRAP染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | 387A-1KTF |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor® 488标记抗小鼠F4/80 | BioLegend | 123119 |
| APC标记抗小鼠CD206 | BioLegend | 141707 | |
| APC标记抗小鼠CXCR2 | BioLegend | 149311 | |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | BioLegend | 156603 | |
| 牙周注射 | 微量注射器 | Hamilton Company | -- |
| 微CT | μCT50微型计算机断层扫描系统 | SCANCO Medical AG | -- |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 发光检测仪（Spark） | Tecan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OTM动物模型 | 小鼠品系（WT/Cxcr2–/–）、8周龄雄性、镍钛弹簧20 g、7天、假手术对照 阅读提示：Materials and methods中Animals and OTM model小节 |
| 体外机械力加载 | Flexcell 5000系统、10%振幅、0.5 Hz、24 h、人PDL成纤维细胞代次P3-P5 阅读提示：Materials and methods中Mechanical force loading method小节 |
| 3PO处理 | 体外10 μmol/L预处理2 h；体内5 μL 2 mmol/L每日一次共7次；溶剂DMSO和生理盐水 阅读提示：Materials and methods中Isolation and culture of human PDL fibroblasts及Periodontal injection小节 |
| BMDMs极化与共培养 | IL-4 20 ng/mL、CXCL1 10 ng/mL、SB225002 50 nmol/L预处理0.5 h、共培养48 h、M-CSF 25 ng/mL 阅读提示：Materials and methods中Isolation and culture of BMDMs及Co-culture of PDL fibroblasts and BMDMs小节 |
| CUT&Tag与抗体 | anti-H3K18la抗体1:50、NovoNGS CUT&Tag 4.0试剂盒、n=3 阅读提示：Materials and methods中CUT&Tag小节 |