小鼠腔前卵泡分离与体外培养
建立可评估高温和MEHP单独及联合暴露对卵泡功能影响的体外模型。
从成年CD-1小鼠分离早期腔前卵泡(250-350 μm)，接种于96孔板，在补充α-MEM中培养，分别暴露于对照温度或高温，以及DMSO或MEHP。
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高温与邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯共暴露抑制小鼠腔前卵泡生长和雌二醇合成：卵巢中邻苯二甲酸酯-高温相互作用
Co-exposure to high temperature and mono(2-ethylhexyl) phthalate inhibits mouse antral follicle growth and estradiol synthesis: Phthalate-heat interactions in the ovary
实验完整度
中采用CD-1小鼠腔前卵泡体外培养，检测卵泡生长、激素水平及细胞周期、类固醇生成、凋亡和氧化应激相关基因表达，包含功能与机制验证，但仅为体外单一模型层级。
主要模型
CD-1小鼠腔前卵泡体外培养模型 成年雌性CD-1小鼠(PND 32-39)
重点核对
卵泡培养温度：对照温度37°C或高温42°C(每24小时8小时) MEHP处理浓度：0.2、2和20 µg/ml，载体为DMSO(最终浓度0.75 µg/ml) 培养时间：24、48、72和96小时 每组每个重复5至10个卵泡，n=4至9个重复 检测终点：卵泡直径变化、雌酮和雌二醇水平、细胞周期、类固醇生成、凋亡和氧化应激相关基因mRNA表达
摘要
人类普遍暴露于邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)，这是一种用于消费品的邻苯二甲酸酯增塑剂，已被确定为生殖毒物。DEHP的毒性由其生物活性代谢物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)介导，MEHP已被证明靶向卵巢过程，包括卵泡发生和类固醇生成。同时，人类普遍暴露于高温等非化学应激源，高温也被证明会损害卵巢功能。鉴于不可避免的同时暴露于日益升高的温度和DEHP，本研究检验了以下假设：暴露于高温会加剧MEHP暴露对腔前卵泡功能的负面影响。将CD-1小鼠的腔前卵泡在对照温度(CT；37°C)或高温(HT；42°C，每24小时8小时)下与载体对照(DMSO)或MEHP(0.2至20 µg/ml)培养24至96小时，以评估对卵泡生长和类固醇生成的影响。与对照(CT+DMSO)相比，HT+DMSO和HT+MEHP抑制细胞周期和类固醇生成途径，并上调促卵泡激素受体表达。CT+MEHP、HT+DMSO和HT+MEHP随时间降低雌二醇水平，且HT+DMSO和HT+MEHP与CT+DMSO相比也抑制腔前卵泡生长。因此，MEHP暴露降低雌二醇水平，而HT暴露和HT+MEHP共暴露通过抑制类固醇生成途径和细胞周期降低雌二醇水平和卵泡生长。此外，还发现了若干显著交互作用，首次提供了哺乳动物模型中邻苯二甲酸酯-高温相互作用的证据。因此，暴露于普遍存在的化学和非化学应激源，如MEHP和HT，会破坏关键的卵巢过程，并在联合暴露时可能加剧卵巢功能障碍。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 高温暴露是否会加剧MEHP暴露对小鼠腔前卵泡生长、类固醇生成和存活的不利影响？
- 核心机制
- MEHP单独暴露降低雌二醇水平；高温单独暴露和高温+MEHP共暴露通过抑制细胞周期和类固醇生成途径，抑制卵泡生长并降低雌二醇水平，且高温与MEHP存在拮抗性交互作用。
- 主要证据
- CD-1小鼠腔前卵泡体外培养显示，HT+DMSO和HT+MEHP抑制卵泡生长，降低雌酮和雌二醇水平，并改变细胞周期和类固醇生成相关基因表达；qPCR和ELISA/Immulite检测支持上述结果，并鉴定出5个显著交互作用。
- 研究意义
- 首次在哺乳动物模型中提供邻苯二甲酸酯-高温相互作用的证据，表明普遍存在的化学和非化学应激源联合暴露可能加剧卵巢功能障碍，推动生殖和环境毒理学领域对热与内分泌干扰物联合暴露机制的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
卵泡生长评估
检测高温和MEHP暴露对腔前卵泡生长的影响。
在0小时及每24小时使用倒置显微镜和目镜测微器测量卵泡垂直直径，计算相对于0小时的百分比变化。
基因表达分析
检测高温和MEHP暴露对细胞周期、类固醇生成、凋亡和氧化应激相关基因mRNA水平的影响。
收集各时间点卵泡，提取RNA，反转录为cDNA，使用qPCR检测目标基因mRNA水平，以Actb为内参，计算2^(-ΔΔCt)相对倍数变化。
性激素水平检测
检测高温和MEHP暴露对腔前卵泡类固醇生成的影响。
收集各时间点培养液，使用ELISA试剂盒检测孕烯醇酮、雄烯二酮和雌酮水平，使用Immulite试剂盒检测孕酮、睾酮和雌二醇水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证激素水平变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞培养 | α-最小必需培养基 | Life Technologies | -- |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 转铁蛋白 | -- | -- | |
| 硒 | -- | -- | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | -- | |
| 人重组促卵泡激素 | Scripps Laboratories | -- | |
| RNA提取 | RNeasy微量试剂盒 | Qiagen, Inc. | -- |
| 反转录 | iScript反转录试剂盒 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | -- |
| qPCR | SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad Laboratories, Inc | -- |
| QuantStudio 3实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantStudio设计与分析软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 引物 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| 激素检测 | 酶联免疫吸附测定试剂盒 | DRG International, Inc. | -- |
| Immulite试剂盒 | Siemens Healthcare Diagnostic Products | -- | |
| Immulite 1000分析仪 | -- | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 10软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 卵泡培养与暴露 | 小鼠品系、年龄、卵泡大小、培养基成分、MEHP浓度、温度条件及暴露时间 阅读提示：参见Materials and methods中In vitro mouse antral follicle culture小节 |
| 卵泡生长测量 | 测量时间点、每组卵泡数量及重复数 阅读提示：参见Materials and methods中Analysis of follicle growth小节及Fig. 1图注 |
| 基因表达分析 | RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、qPCR试剂、引物序列及内参基因 阅读提示：参见Materials and methods中Analysis of gene expression小节及Table 1 |
| 激素水平检测 | ELISA和Immulite试剂盒、检测灵敏度、样本稀释及复孔设置 阅读提示：参见Materials and methods中Analysis of sex steroid hormone levels小节及Fig. 3图注 |
| 统计分析 | 统计软件、统计方法、事后检验及显著性阈值 阅读提示：参见Materials and methods中Statistical analysis小节 |