空间转录组与单细胞测序鉴定上皮异质性
表征牙周炎牙龈上皮的空间组织和细胞亚群。
对健康对照和牙周炎患者牙龈组织进行ST和scRNA-seq，整合分析鉴定上皮区域和亚群。
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空间分辨单细胞图谱解码SAA1炎症上皮细胞
Spatially resolved single cell atlas deciphers SAA1 inflammatory epithelial cells
实验完整度
高包含空间转录组、scRNA-seq、宏基因组及人组织、小鼠模型和体外细胞实验，并进行了功能与机制验证。
主要模型
人牙龈组织（健康对照和牙周炎患者） C57BL/6J小鼠牙周炎模型 HGE细胞 HGF细胞
重点核对
空间转录组和scRNA-seq样本量：ST 4健康对照+6牙周炎患者；scRNA-seq 2健康对照+6牙周炎患者。 P. gingivalis LPS处理HGE细胞浓度100 ng/mL，时间24 h。 PITX2 siRNA局部注射剂量20 nmol/L/次，每3天一次，持续3周。 小鼠模型：8周龄雄性C57BL/6J，丝线结扎并涂抹P. gingivalis W83，每2天一次，持续2周。 Transwell共培养：HGE经P. gingivalis LPS刺激后与成纤维细胞共培养24 h。
摘要
上皮完整性的破坏是炎症、疾病发病机制和组织稳态中的关键事件。为在慢性炎症性疾病中研究这些过程，我们对人类牙龈组织进行了空间转录组学与单细胞RNA测序（scRNA-seq）的整合，并结合配对龈下菌斑的宏基因组分析。该方法允许对上皮异质性及微生物组-上皮-结缔组织串扰进行原位表征。我们鉴定出一个独特的炎症上皮亚群（SAA1+Epi），位于结合上皮内，通过TLR2-PITX2轴被牙龈卟啉单胞菌脂多糖激活。这些SAA1+Epi细胞分泌TGFβ，通过PI3K/Akt途径驱动炎症相关成纤维细胞（C3+FB）的分化，从而在结缔组织中诱导炎症程序。同时，SAA1+Epi细胞表达如CXCL6等趋化因子以招募NK细胞，从而维持炎症生态位。转录因子PITX2成为SAA1+Epi分化的关键调节因子；靶向PITX2抑制了C3+FB诱导和自然杀伤（NK）细胞招募，最终减轻牙周炎进展。我们的发现将SAA1+Epi定位为炎症界面处失调细菌的一线响应者，并强调其在炎症期间调节上皮-结缔组织稳态中的重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 牙周炎中上皮异质性如何被微生物组调控，以及特定上皮亚群如何驱动结缔组织和免疫微环境重塑？
- 核心机制
- P. gingivalis LPS通过TLR2-ERK1/2-Smad2/3-PITX2轴激活SAA1+Epi分化；SAA1+Epi通过TGFβ/PI3K/Akt诱导C3+FB，并通过CXCL6等趋化因子招募NK细胞。
- 主要证据
- 空间转录组和scRNA-seq鉴定SAA1+Epi位于Epithelium-3；体外HGE实验验证TLR2-PITX2轴；小鼠模型和人类组织mIF验证SAA1+Epi、C3+FB和NK细胞的空间共定位；siPitx2干预减轻牙周炎。
- 研究意义
- 将牙龈上皮从被动屏障转变为疾病进展的主动协调者，提出靶向TLR2-PITX2轴可能实现牙周炎疾病修饰治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定SAA1+Epi亚群及其空间定位
确定SAA1+Epi在Epithelium-3中的富集和病理相关性。
通过RCTD推断空间分布，mIF验证SAA1+Epi在人牙龈和小鼠模型中的定位。
微生物组分析及P. gingivalis LPS激活验证
探究微生物触发SAA1+Epi的机制。
对配对龈下菌斑进行宏基因组测序，SAHMI分析宿主-微生物互作；体外用P. gingivalis LPS刺激HGE细胞。
TLR2-PITX2轴机制验证
验证P. gingivalis LPS通过TLR2-PITX2轴激活SAA1+Epi。
使用TLR2抑制剂C29、PITX2 siRNA和过表达、ERK1/2抑制剂SCH772984、Smad2/3抑制剂LY364947处理HGE细胞，Western blot和qPCR检测。
体内PITX2抑制验证
评估靶向PITX2对牙周炎进展的影响。
在牙周炎小鼠模型中局部注射Pitx2 siRNA，micro-CT和mIF评估骨丢失和炎症。
SAA1+Epi对成纤维细胞和NK细胞的影响
探究SAA1+Epi如何重塑结缔组织和免疫微环境。
Transwell共培养SAA1+HGE与成纤维细胞，检测C3+FB标志物和TGFβ/PI3K/Akt；分析SAA1+Epi与NK细胞的配体-受体互作。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | ZETA | Z7185FBS-500 | |
| 青霉素和链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 细胞刺激 | 牙龈卟啉单胞菌脂多糖 | InvivoGen | -- |
| RNA提取和qPCR | RNAiso Easy试剂盒 | Takara | TCH021 |
| HiScript III RT SuperMix试剂盒 | Vazyme | R323-01 | |
| Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒 | Vazyme | Q712-02 | |
| 荧光原位杂交 | 溶菌酶 | Solarbio | 12650-88-3 |
| 转染 | TSnanofect V2转染试剂 | Tsingke | TSV405 |
| 聚凝胺 | Yeasen | 40804ES76 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| SDS-PAGE凝胶 | Yeasen | 36246ES10, 36253ES10 | |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | SW3015 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 |
| 山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| DAPI | Thermo | D1306 | |
| 空间转录组 | Visium空间基因表达载玻片与试剂盒 | 10× Genomics | PN-1000184 |
| Visium空间基因表达载玻片试剂盒 | 10× Genomics | PN-1000185 | |
| 单细胞RNA测序 | 胶原酶 | Roche | -- |
| DNase I | -- | -- | |
| 宏基因组测序 | ZymoBIOMICS DNA小量制备试剂盒 | Zymo | -- |
| Qubit 4.0荧光计 | -- | -- | |
| Covaris M220聚焦超声仪 | Covaris | -- | |
| 动物实验 | 微型CT | SCANCO Medical | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 空间转录组和scRNA-seq | 样本量：ST 4健康对照+6牙周炎患者；scRNA-seq 2健康对照+6牙周炎患者。 阅读提示：Methods中Sample collection和Spatial transcriptomic sequencing部分，以及Fig. 1a。 |
| P. gingivalis LPS刺激HGE细胞 | LPS浓度100 ng/mL，处理时间24 h。 阅读提示：Methods中Cell lines and cell culture部分。 |
| 小鼠牙周炎模型 | 8周龄雄性C57BL/6J，丝线结扎，P. gingivalis W83每2天涂抹一次，持续2周。 阅读提示：Methods中Animals部分。 |
| Pitx2 siRNA局部注射 | 剂量20 nmol/L/次，每3天一次，持续3周。 阅读提示：Methods中Small interfering RNA transfection部分。 |
| Transwell共培养 | HGE经P. gingivalis LPS刺激后与成纤维细胞共培养24 h。 阅读提示：Methods中Transwell assay部分。 |