A BACH1 inhibitor ameliorates myocardial infarction and limb ischemia in mice
包含体外HUVECs/LECs、BACH1敲除内皮细胞、心肌梗死和下肢缺血小鼠模型，并进行功能表型、机制和体内验证
HUVECs（人脐静脉内皮细胞） 小鼠原代肺内皮细胞（LECs，Bach1WT和Bach1ECKO） 8周龄C57BL/6J小鼠心肌梗死模型 8周龄C57BL/6J小鼠后肢缺血模型
BI033与BACH1结合位点：N端第91位丙氨酸，BACH1 91W突变后BLI无法结合（KD=9.0 ± 1.6 μM） 体外处理浓度与时间：BI033 1 μM处理HUVECs 24 h、36 h或48 h用于基因/蛋白/功能检测 心肌梗死模型给药：1 mg/kg BI033，MI术后梗死边缘区单次肌内注射，并于MI后2、4、6、10、17、24天腹腔注射 后肢缺血模型给药：1 mg/kg BI033，术前2、4天或术后0、3天肌内注射 主要终点检测：超声心动图EF/FS、Masson纤维化面积、CD31+毛细血管密度、α-SMA+小动脉密度、HO-1/VEGFA/BACH1蛋白表达
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从化合物库中筛选潜在BACH1抑制剂并缩小候选范围。
以人BACH1 BTB结构域2IHC_A为模板，用Modeller优化结构，对Specs数据库131,549个化合物进行Libdock对接，筛选LibDockScore >100的前106个命中物，再依据ADMET Predictor排除ADMET_Risk >6及CYP3A/CYP2D/CYP2C底物，得到11个化合物和23个类似物；通过HO-1表达筛选鉴定BI016、BI019、BI022、BI033和BI034。
验证BI033是否直接结合BACH1并确定关键结合位点。
通过Libdock预测BACH1 BTB结构域第91位残基为候选结合位点，构建BACH1 91W突变体，用BLI检测BACH1 WT和BACH1 91W与BI033的结合亲和力；并用HO-1荧光素酶报告基因在过表达BACH1 WT或BACH1 91W的HUVECs中检测BI033效应。
确认BI033是否通过抑制BACH1促进内皮细胞血管生成功能。
从Bach1WT和Bach1ECKO小鼠分离原代肺内皮细胞（LECs），用BI033（1 μM）处理，检测Bach1、Hmox1、Vegfa mRNA，transwell迁移和EdU增殖；同时在HUVECs中检测BI033对增殖、迁移和成管的影响，并与HPPE比较。
评估BI033在小鼠中的短期安全性并确定后续体内实验剂量。
对8周龄C57BL6/J雌雄小鼠每2天腹腔注射BI033（1和5 mg/kg）或vehicle，持续14天；监测体重，检测心、肝、脾、肺、肾H&E，血常规和血生化。
评估BI033对心肌梗死后心功能、瘢痕和血管生成的影响。
对8周龄C57BL/6J雄性小鼠行LAD结扎诱导MI，术后梗死边缘区单次肌内注射vehicle或BI033（1 mg/kg），并在MI后2、4、6、10、17、24天腹腔注射；在0、7、14、21、28天行超声心动图，28天取材进行Masson染色、CD31/α-SMA免疫染色和HO-1/VEGFA/BACH1免疫印迹。
评估BI033对后肢缺血后血流灌注和血管生成的影响。
对8周龄C57BL/6J雄性小鼠行股动脉结扎和切除诱导HLI，BI033（1 mg/kg）或vehicle通过术前和术后策略肌内注射；用激光多普勒成像检测血流，14天取材进行CD31/α-SMA免疫染色和HO-1/VEGFA/BACH1免疫印迹。
解析BI033促进血管生成相关基因表达及抑制炎症的分子机制。
对BI033（1 μM，36 h）处理的HUVECs进行bulk RNA-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR、亚细胞组分免疫印迹、免疫荧光和co-IP；检测BACH1、NRF2、HDAC1、H3K27ac在HMOX1、VEGFA、CCND1、ATF3等基因增强子/启动子的富集，以及ICAM1、VCAM1、SELE表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | ScienCell | 1001 |
| 内皮细胞生长补充剂 | ScienCell | 1052 | |
| DMEM培养基 | Invitrogen | 12800082 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10099-141 | |
| 胎牛血清 | ScienCell | 0025 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000-015 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 细胞裂解 | PMSF | Beyotime | ST505 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | HY-K0010 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8 | MCE | HY-K0301 |
| EdU | Beyotime | C0071 | |
| 组织染色 | Masson三色染色试剂盒 | Yeasen | 60532ES66 |
| ChIP | 蛋白酶K | Yeasen | 10401ES60 |
| 免疫沉淀 | Protein A/G PLUS-Agarose | Santa Cruz Laboratories | sc-2003 |
| HA Nanoab琼脂糖珠 | Everylab | IP07 | |
| Anti-FLAG G1亲和树脂 | GenScript | L00432 | |
| RT-qPCR | ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒 | Toyobo | FSQ-101 |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech | Q341 | |
| CUT&Tag | Hyperactive原位ChIP文库构建试剂盒 | Vazyme Biotech | TD901-01 |
| 质粒转染 | JetPEI转染试剂 | Polyplus-Transfection SA | 24765-1 |
| ChIP | RNase A | Thermo Fisher | EN0531 |
| 免疫荧光 | 驴血清 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-121 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure山羊抗小鼠IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure山羊抗兔IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-545-003 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure山羊抗兔IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-585-003 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | B40958 | |
| CD31 | R&D Systems | AF3628 | |
| ACTA2 | Abcam | ab7817 | |
| 594 nm偶联抗小鼠二抗 | Proteintech | RGAM004 | |
| 抗BACH1抗体 | Santa Cruz Laboratories | sc-271211 | |
| 抗NRF2抗体 | HuaBio | JE30-14 | |
| 免疫印迹 | HO-1 | Abcam | ab52947 |
| VEGFA | Proteintech | 19003-1-AP | |
| NRF2 | ABclonal | A3577 | |
| β-actin | Santa Cruz Laboratories | sc-47778 | |
| GAPDH | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| β-tubulin | Proteintech | 10094-1-AP | |
| 组蛋白H3 | Cell Signaling Technology | 9715 | |
| 免疫沉淀 | HA | Santa Cruz Laboratories | sc-7392 |
| FLAG标签抗体 | GenScript | A00187 | |
| ChIP | HDAC1 | Active Motif | 91215 |
| H3K27ac | EMD Millipore | 07–360 | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 荧光素酶检测试剂盒 | Promega | E1500 |
| BLI | NTA生物传感器 | Sartorius | 18-5101 |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- |
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 354234 |
| Falcon 70 μm细胞筛网 | Corning | 352350 | |
| IV型胶原酶 | Invitrogen | 17104019 | |
| Dynabeads羊抗大鼠IgG | Thermo Fisher | 11035 | |
| 大鼠抗小鼠CD31 | BD Pharmingen | 553370 | |
| 大鼠抗小鼠CD144 | BD Pharmingen | 740933 | |
| BSA | Yeasen | 6101ES60 | |
| 核质分离 | 核质蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0028 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HUVECs与LECs细胞实验 | 细胞来源、代次、培养基、处理浓度与时间：HUVECs传代1至6次，BI033 1 μM处理24 h、36 h或48 h；LECs分离自Bach1WT和Bach1ECKO小鼠 阅读提示：Methods的Cell culture and plasmid transfection、Primary culture of mouse LECs，以及Figure 1至Figure 3图注 |
| BI033与BACH1结合验证 | BACH1 WT和BACH1 91W蛋白构建、NTA Biosensor捕获条件、BI033浓度梯度、PBST缓冲液和25°C条件、KD计算方式 阅读提示：Methods的BLI，以及Figure 2E图注 |
| 心肌梗死模型及给药 | 小鼠品系与性别：8周龄C57BL/6J雄性；LAD结扎位置；BI033剂量1 mg/kg；梗死边缘区单次肌内注射及MI后2、4、6、10、17、24天腹腔注射；超声心动图时间点0、7、14、21、28天 阅读提示：Methods的MI model和Echocardiography，以及Figure 4A、4D、4E图注 |
| 后肢缺血模型及给药 | 小鼠品系与性别：8周龄C57BL/6J雄性；股动脉近端和隐动脉远端结扎并切除；BI033 1 mg/kg肌内注射，预处理为术前2和4天，后处理为术后0和3天；总注射体积40 μL；激光多普勒检测时间点 阅读提示：Methods的Ischemic hindlimb model，以及Figure 5A、5B图注 |
| RNA-seq、CUT&Tag和ChIP-qPCR机制实验 | BI033处理浓度与时间：1 μM，RNA-seq为36 h，ChIP-qPCR和亚细胞组分为24 h；RNA-seq差异基因标准fold change >1.5且p < 0.05；抗体货号；ChIP片段化大小200至400 bp；CUT&Tag细胞数50,000 阅读提示：Methods的RNA isolation, real-time qPCR, and RNA-seq；RNA-seq and analysis for HUVECs；ChIP and ChIP-qPCR；CUT&Tag，以及Figure 6和Figure 7图注 |
| BI033体内短期毒性评估 | 小鼠品系与性别：8周龄C57BL6/J雌雄小鼠；BI033剂量1和5 mg/kg，腹腔注射每2天一次，持续14天；每组n = 3；血常规和血生化分析仪器 阅读提示：Methods的Acute toxicity study，以及Figure 4A–4C、Figure S3图注 |
