腹水蛋白质组学分析
鉴定恶性腹水中的差异表达蛋白和富集通路
对397份恶性腹水和34份良性腹水进行TMT定量质谱分析，鉴定差异表达蛋白并进行通路富集分析
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通过腹水的整合蛋白质转录组学分析鉴定腹膜转移中新型旁分泌治疗靶点
Identification of novel paracrine therapeutic targets in peritoneal metastases through integrative proteotranscriptomic analysis of ascites
实验完整度
高包含蛋白质组学、单细胞转录组、空间转录组、体外细胞、体内小鼠模型和离体人外植体等多层级验证，并进行了功能与机制验证。
主要模型
COLO-205、KATO III、OVCAR3细胞系 NCr nude小鼠腹膜转移模型 患者来源的离体人外植体模型 PM患者腹水样本及配对肿瘤组织
重点核对
恶性无细胞腹水样本量：397份恶性，34份良性 细胞系处理条件：7.5 µg/mL E8或VHH对照，15 µg/mL E8用于STAT3检测 体内模型：5×10^6 COLO-205细胞与5% PAI-1-high腹水共注射，每3天腹腔注射20 µg E8或对照，共21天 离体人外植体：20 µg/mL E8、20 µg/mL VHH对照、250 µM TM5441、250 µM TM5614或DMSO处理24小时 纳米抗体E8系统毒性评估：20、50、100、150 µg静脉注射，n=2雌2雄/剂量
摘要
背景：腹膜转移（PM）中的腹水预示着不良预后。然而，腹水中的分子配体及其生物学相关性仍不清楚。方法：进行了全面的多组学分析，包括对代表21种PM组织学来源的397份恶性无细胞腹水进行蛋白质组学分析，以解读相关生物学主题，鉴定并验证无细胞腹水中具有治疗相关性的旁分泌因子，并揭示关键旁分泌因子的细胞特异性分泌。我们进一步开发了靶向PAI-1的纳米抗体，并在体外、体内和离体人外植体模型中进行了测试。结果：质谱分析鉴定出多个生物学主题，包括凝血级联反应。还发现了新的和先前鉴定的可用于治疗干预的旁分泌因子。单细胞转录组分析证实，PM腹水中不同细胞群体分泌两种功能拮抗的纤溶调节因子（S100A10和PAI-1），提示这些配体的上调是由于细胞的主动分泌而非稳态调节。我们还证明了抗PAI-1纳米抗体的有效性概念验证，且毒性最小。结论：总体而言，本研究探索了PM恶性无细胞腹水中蛋白质的生物学意义，并介绍了通过纳米抗体靶向PAI-1的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 腹膜转移患者腹水中的旁分泌因子组成及其作为治疗靶点的潜力是什么？
- 核心机制
- PM肿瘤细胞通过“旁分泌成瘾”机制劫持腹水中凝血和纤溶通路的关键调节因子，如PAI-1通过激活STAT3信号促进肿瘤生长，而S100A10作为纤溶酶原受体促进纤溶酶生成。
- 主要证据
- 蛋白质组学分析397份恶性腹水发现凝血通路富集和PAI-1/S100A10上调；单细胞转录组揭示其细胞来源；纳米抗体E8在体外抑制细胞活力、在体内减少肿瘤负荷、在离体人外植体中降低肿瘤活性并抑制STAT3激活。
- 研究意义
- 提供了PM恶性无细胞腹水的综合蛋白质组资源，揭示了靶向PAI-1的纳米抗体E8作为PM治疗策略的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选治疗靶点筛选与验证
筛选并验证具有治疗潜力的旁分泌因子
交叉参照Kaplan-Meier plotter数据库和ChEMBL数据库，使用小分子抑制剂（GSK2837808A、Z57346765、A2ti-1）在腹水存在下处理细胞系，测定IC50
单细胞转录组分析
揭示PAI-1和S100A10的细胞来源
对10名PM患者的20份配对肿瘤和腹水样本进行scRNA-seq，分析SERPINE1和S100A10表达
纳米抗体E8的生成与表征
开发靶向PAI-1的纳米抗体并验证其结合和中和活性
通过噬菌体展示筛选VHH文库，表达纯化E8，使用Western blot和SPR检测结合，使用显色法定量tPA和uPA抑制
E8体内系统毒性评估
评估E8静脉注射的安全性
NCr nude小鼠静脉注射不同剂量E8或PBS，监测体重、血液学、生化和组织病理学
E8体内疗效评估
评估E8在腹膜转移小鼠模型中的抗肿瘤效果
COLO-205细胞与PAI-1-high腹水或FBS共注射至小鼠腹腔，腹腔注射E8或对照，评估肿瘤负荷
E8离体人外植体疗效评估
在患者来源的外植体模型中验证E8的抗肿瘤活性
10例PM患者来源的肿瘤外植体培养，处理24小时后用resazurin检测活力
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样品制备 | 尿素 | Sigma-Aldrich | U5378 |
| 三乙基碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | T7408 | |
| 二辛可宁酸检测 | Thermo Scientific | 23227 | |
| 三(2-羧乙基)膦 | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V511B | |
| 96孔SOLAµ固相萃取板 | Thermo Scientific | 60209-001 | |
| NanoDrop Eight分光光度计 | Thermo Scientific | 912A1100 | |
| 质谱分析 | TMTpro 16plex试剂 | Thermo Scientific | 44520 |
| Proteome Discoverer软件 | Thermo Scientific | 2.5.0.400 | |
| 单细胞测序 | VIA Extractor™组织解离器 | Cytiva | -- |
| Chromium iX仪器 | 10X Genomics | -- | |
| 10X Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒 | 10X Genomics | PN1000123 | |
| Agilent Bioanalyzer高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina NovaSeq X测序平台 | Illumina | -- | |
| 噬菌体展示 | VHH骆驼天然LiAb-VHHMAXTM文库 | ProteoGenix | -- |
| 稳定活性PAI-1 | Innovative Research | IHUPAI1RSM1MG | |
| 潜伏型PAI-1 | Innovative Research | IHUPAI1RWTL1MG | |
| TM5441 | Axon Medchem | 2734 | |
| Tiplaxtinin | Selleckchem | S7922 | |
| 离体人外植体实验 | TM5614 | Excenen Pharmatech | EX-A7250 |
| 空间转录组学 | Stereo-seq P芯片 | STOmics, MGI Tech | 411KP118 |
| Stereo-seq T芯片 | STOmics, MGI Tech | 411KT118 | |
| Stereo-seq文库引物 | STOmics, MGI Tech | 111KL114 | |
| 组织学分析 | Zeiss AxioScan 7 | Carl Zeiss Microscopy | -- |
| Zeiss Zen软件 | Carl Zeiss Microscopy | version 3.7 | |
| 图像分析 | QuPath软件 | -- | v0.5.0 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 药物处理 | GSK2837808A | -- | -- |
| Z57346765 | -- | -- | |
| A2ti-1 | -- | -- | |
| 穗花杉双黄酮 | -- | -- | |
| 奥沙利铂 | -- | -- | |
| 奥拉帕利 | -- | -- | |
| 瑞戈非尼 | -- | -- | |
| Napabucasin | -- | -- | |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 腹水蛋白质组学分析 | 恶性腹水样本量n=397，良性腹水n=34，组织学来源21种，TMTpro 16-plex标记，31批次，差异表达阈值|log2FC|>log2(1.5)且p<0.05 阅读提示：Methods中Mass spectrometry部分及Table S1、S2 |
| 候选靶点功能验证 | 细胞系COLO-205、KATO III、OVCAR3，抑制剂GSK2837808A、Z57346765、A2ti-1，腹水样本n=7或n=4，处理时间未明确说明 阅读提示：Methods中相关部分及Figure 4B、4D、4G图注 |
| 纳米抗体E8的生成与表征 | 噬菌体展示筛选240个单克隆噬菌体，竞争ELISA使用TM5441和Tiplaxtinin，E8表达于E. coli，内毒素<10 EU/mL，SPR测定KD值 阅读提示：Methods中Phage display部分及Figure 6D-F图注 |
| E8体内系统毒性评估 | NCr nude小鼠，剂量20、50、100、150 µg E8，n=2雌2雄/剂量，PBS组n=3雌3雄，静脉注射，第14天处死，禁食16小时 阅读提示：Methods中In vivo systematic toxicity assessment部分及Figure 6I图注 |
| E8体内疗效评估 | COLO-205细胞5×10^6与5% PAI-1-high恶性腹水或10% FBS共注射，NCr nude雌鼠n=10/组，腹腔注射20 µg E8、20 µg VHH对照或PBS，每3天一次共21天，PCI评分 阅读提示：Methods中In vivo PM cell line mouse model for drug treatment部分及Figure 7E图注 |
| E8离体人外植体疗效评估 | 10例PM患者来源外植体，药物20 µg/mL E8、20 µg/mL VHH对照、250 µM TM5441、250 µM TM5614或DMSO，处理24小时，resazurin检测，每种条件至少3个外植体 阅读提示：Methods中Ex vivo human explant tumor model for drug treatment部分及Figure 7H图注 |
| 单细胞转录组分析 | 10名PM患者，20份配对肿瘤和腹水样本，细胞浓度800 cells/µL，目标回收10,000个单细胞，Illumina NovaSeq X测序，PE150，目标20,000 read pairs/细胞 阅读提示：Methods中Single-cell RNA-sequencing部分及Figure 5A图注 |
| 空间转录组学 | 2例新鲜冷冻组织，切片厚度10 μm，Stereo-seq P-chips和T-chips，测序深度1 billion reads，最小500 median gene counts per DNB 阅读提示：Methods中Spatial transcriptomics部分 |