体外模型建立与暴露
建立人支气管上皮细胞系和重建人呼吸道上皮模型，并进行表面活性剂暴露。
BEAS-2B细胞培养于气液界面，MucilAir组织培养于插入式小室，分别以液体方式暴露于五种浓度的油酰肌氨酸或Triton X-100 24小时。
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用于评估表面活性剂点接触呼吸道毒性并推导单次暴露后人体等效浓度的人体外气道模型
Human in vitro airway models to assess point-of-contact respiratory toxicity of surfactants and derive human equivalent concentrations after single dose exposure
实验完整度
中使用BEAS-2B和MucilAir两种体外模型评估细胞活力、细胞毒性、炎症因子、屏障完整性和纤毛功能，但仅体外实验，无体内验证。
主要模型
BEAS-2B细胞系 MucilAir重建人呼吸道上皮模型
重点核对
BEAS-2B细胞暴露24小时，油酰肌氨酸浓度0.6、1.2、1.8、2.4、3 µg/cm²，Triton X-100浓度3、6、9、12、15 µg/cm² MucilAir组织暴露24小时，油酰肌氨酸和Triton X-100浓度均为5、10、20、40、80 µg/cm² 液体暴露体积30 µl（91 µl/cm²），施加于 apical 面 每实验独立重复3次（n=3），MucilAir每次使用不同单供体 阳性对照：LPS 20 µg/ml（BEAS-2B）或200 µg/ml（MucilAir）用于炎症；ISO 50 µM用于CBF
摘要
表面活性剂广泛用于肥皂、粘合剂和农化制剂等产品中，作为乳化剂、润湿剂、洗涤剂、发泡剂或分散剂。尽管存在吸入暴露的可能性，但与人相关的危害数据有限。表面活性剂可与两亲性细胞膜相互作用，破坏膜完整性并导致细胞毒性。为评估这些化学物质的点接触呼吸道组织刺激性，将人支气管上皮细胞系（BEAS-2B）和重建人呼吸道上皮（RHRE；MucilAir）模型暴露于两种表面活性剂——油酰肌氨酸或Triton X-100，形式为气溶胶（仅BEAS-2B细胞）或液体（两种系统）。由于气溶胶暴露与液体暴露的结果趋势相似且需要进一步技术优化，未进一步采用气溶胶暴露。细胞暴露于30µl（91µl/cm²）的任一表面活性剂24小时，共五个浓度。在BEAS-2B细胞和MucilAir中于暴露24小时后评估细胞效应，在MucilAir中仅于暴露开始后7天评估。总体而言，在每个细胞系统中，两种表面活性剂均观察到剂量依赖性效应。油酰肌氨酸在BEAS-2B细胞中比Triton X-100毒性更强，而在MucilAir中未观察到两种表面活性剂之间的明显毒性差异。进行基准剂量（BMD）和多路径粒子剂量测定（MPPD）建模，将体外数据转化为人体等效浓度（HEC）。本文展示了应用体外测试方法和体外到体内外推（IVIVE）来预测人体点接触呼吸道组织刺激性的能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 体外模型能否可靠评估表面活性剂的点接触呼吸道刺激性，并将体外结果转化为人体等效浓度？
- 核心机制
- 表面活性剂与细胞膜相互作用，破坏膜完整性（LDH释放增加），降低细胞活力和屏障完整性（TEER下降），诱导炎症因子（IL-6、CXCL-8）分泌，并损害纤毛功能（AAA和CBF改变）。
- 主要证据
- 在BEAS-2B和MucilAir模型中，两种表面活性剂均引起浓度依赖性细胞活力下降、细胞毒性增加、炎症因子分泌增加、TEER下降及纤毛活性改变；油酰肌氨酸在BEAS-2B中毒性更强，而Triton X-100在MucilAir中BMDL更低。
- 研究意义
- 该研究展示了体外测试结合IVIVE工作流可预测人体点接触呼吸道刺激性，为评估表面活性剂吸入危害提供人相关数据，减少动物实验需求。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞活力与细胞毒性评估
评估表面活性剂对细胞代谢活性和膜完整性的影响。
使用PrestoBlue assay检测细胞活力，LDH assay检测细胞毒性，在暴露24小时后（MucilAir额外7天）进行。
炎症因子分泌检测
评估表面活性剂诱导的促炎反应。
使用MSD V-PLEX assay检测基底外侧培养基中IL-6和CXCL-8浓度。
屏障完整性评估
评估表面活性剂对上皮屏障功能的影响。
使用EVOM voltohmmeter测量MucilAir组织的TEER，在暴露前、暴露24小时后和7天后测量。
纤毛功能评估
评估表面活性剂对纤毛活性和平均活跃面积的影响。
使用Zeiss Axiovert显微镜和Basler相机记录5秒视频，CiliaX软件分析AAA和CBF。
组织学检查
观察表面活性剂引起的形态学变化。
MucilAir组织固定、包埋、切片，进行Alcian Blue/PAS/Hematoxylin染色，数字化扫描。
BMD建模与HEC推导
将体外浓度-反应数据转化为人体等效浓度。
使用BMDS Online进行BMD分析，结合EPA MPPD v2.0模型模拟气溶胶沉积，计算HEC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 支气管上皮细胞基础培养基 | -- | -- |
| BEGM BulletKit | -- | -- | |
| TrypLE Express酶 | -- | -- | |
| 人血浆纤连蛋白 | -- | -- | |
| VitroCol | -- | -- | |
| 人血清白蛋白 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | PrestoBlue细胞活力试剂 | -- | -- |
| 细胞毒性检测 | LDH检测试剂盒-WST | Dojindo | -- |
| 炎症因子检测 | Meso Scale Discovery V-PLEX检测 | Meso Scale Discovery | -- |
| 屏障完整性检测 | EVOM手动伏欧计 | -- | -- |
| STX4 EVOM电极 | -- | -- | |
| 纤毛功能检测 | Zeiss Axiovert显微镜 | Zeiss | -- |
| Basler acA1300-200 µm USB3摄像机 | Basler | -- | |
| 组织学 | NANOZOOMER-S360扫描仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞暴露 | 暴露体积30 µl（91 µl/cm²），暴露时间24小时，浓度范围 阅读提示：Methods: Exposure of BEAS-2B cells to test chemicals; Exposure of bronchial MucilAir tissues to test chemicals; Table 1 |
| 细胞活力与细胞毒性检测 | PrestoBlue assay孵育时间1小时，LDH assay反应时间30分钟 阅读提示：Methods: Mitochondrial activity to determine cell viability; Cellular membrane integrity using LDH assay |
| 炎症因子检测 | 样本稀释10倍，校准曲线，检测时间点24小时和7天 阅读提示：Methods: Proinflammatory markers; Figure 3, Figure 5 |
| 屏障完整性检测 | TEER测量时间点，电极校准方法 阅读提示：Methods: Barrier integrity (TEER, MucilAir only); Figure 6 |
| BMD建模与HEC推导 | BMR=1SD，模型选择标准，MPPD参数（ ventilation rate, particle size, GSD） 阅读提示：Methods: BMD modelling; MPPD modelling for IVIVE; Table 3, Table 4, Table 5 |