公共数据库与临床队列分析HLA-E/NKG2A表达及预后
评估NKG2A和HLA-E在HCC中的表达模式、与免疫浸润的相关性及预后价值。
分析TCGA LIHC队列中NKG2A（KLRC1）和HLA-E mRNA表达；对SYSU队列HCC组织进行IHC检测HLA-E；对EMC队列165例HCC TMA进行HLA-E、HLA-A/B/C和CD8免疫组化染色及生存分析。
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NKG2A-HLA-E轴参与肝细胞癌中的免疫抑制检查点网络
NKG2A-HLA-E axis contributes to an immunosuppressive checkpoint network in hepatocellular carcinoma
实验完整度
高包含HCC患者组织、外周血流式分析、单细胞RNA/TCR测序、体外功能实验及小鼠原位肝肿瘤模型体内验证。
主要模型
HCC患者肿瘤组织及配对正常肝组织 HCC患者外周血单个核细胞（PBMC） HCC细胞系HepG2、Huh7、Hep3B C57BL/6小鼠Hepa1-6-luciferase原位肝肿瘤模型
重点核对
SYSU队列56例HCC患者肿瘤与配对正常肝组织及PBMC的流式细胞术分析 EMC队列165例HCC患者TMA的HLA-E、HLA-A/B/C及CD8免疫组化染色与生存分析 NKG2A或PD-1阻断抗体（10 µg/mL）处理TIL 4天或1天后的流式细胞术功能检测 体外共培养杀伤实验：HLA-A匹配HCC细胞系与肿瘤浸润免疫细胞共培养，检测活肿瘤细胞计数 小鼠原位肝肿瘤模型：Hepa1-6-luciferase细胞注射C57BL/6小鼠，第7天开始给予抗NKG2A（20D5或16A11）和/或抗PD-1抗体治疗
摘要
背景：肝细胞癌（HCC）中的免疫抑制肿瘤微环境限制了当前免疫疗法的疗效。新出现的抑制性受体NKG2A与其激活型对应受体NKG2C（两者均结合HLA-E）之间的相互作用及其与PD-1-PD-L1通路在肿瘤中的关系仍不清楚。本研究旨在阐明这些通路在塑造HCC免疫抑制格局中形成的功能网络。方法：我们分析了公共数据库并对HCC组织进行免疫组织化学分析，以评估HLA-E表达及预后相关性。通过流式细胞术检测患者样本中的肿瘤浸润淋巴细胞，以评估NKG2A、NKG2C和PD-1表达对T细胞和NK细胞的功能影响。采用单细胞RNA和T细胞受体（TCR）测序来表征免疫亚群的异质性。使用功能实验和小鼠模型评估NKG2A和PD-1阻断的效果。结果：在缺乏CD8+ T细胞浸润的情况下，HCC组织中HLA-E表达升高与未接受免疫治疗患者较差的总体生存相关。相反，在存在CD8+ T细胞的情况下，高HLA-E表达与以产生IFN-γ的T细胞和主要组织相容性复合体I增加为特征的炎性肿瘤微环境相关，这与患者对免疫治疗更好的反应相关。来自HCC患者的肿瘤浸润CD8+ T和NK细胞上调NKG2A，赋予组织驻留记忆和肿瘤反应性特征，同时损害细胞毒性功能。单细胞RNA和TCR测序揭示了NKG2A、NKG2C和PD-1在不同T和NK细胞亚群中的差异表达模式，其中NKG2A+ PD-1+ T细胞与抗原特异性克隆扩增相关。机制上，NKG2A-HLA-E轴介导的抑制作用在抑制抗肿瘤免疫方面比NKG2C-HLA-E轴的刺激作用更为显著。此外，NKG2A-HLA-E轴与PD-1-PD-L1轴协同作用，促进CD8+ T细胞功能障碍。联合阻断NKG2A和PD-1增强了肿瘤浸润CD8+ T和NK细胞的细胞毒性活性，在体外和体内均导致有效的肿瘤清除，优于单药治疗。结论：我们的发现将NKG2A-HLA-E轴确定为与HCC免疫抑制相关的重要免疫调节通路，并为进一步评估联合NKG2A和PD-1阻断策略提供了依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NKG2A-HLA-E轴与NKG2C-HLA-E轴及PD-1-PD-L1通路在肝细胞癌免疫抑制微环境中如何相互作用并影响抗肿瘤免疫？
- 核心机制
- NKG2A-HLA-E轴介导的抑制信号强于NKG2C-HLA-E轴的刺激信号，并与PD-1-PD-L1轴协同促进CD8+ T细胞功能障碍，从而抑制抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- HCC患者样本流式细胞术显示肿瘤浸润CD8+ T和NK细胞NKG2A上调且细胞毒性分子（granzyme B、perforin）降低；单细胞RNA/TCR测序揭示NKG2A+PD-1+ T细胞与抗原特异性克隆扩增相关；体外阻断实验表明NKG2A阻断增强细胞毒性且联合PD-1阻断效果更优；小鼠原位肝肿瘤模型显示联合阻断NKG2A和PD-1优于单药治疗。
- 研究意义
- 将NKG2A-HLA-E轴确定为HCC免疫抑制的重要通路，为联合NKG2A和PD-1阻断策略的进一步临床评估提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞表型与功能
验证NKG2A在肿瘤浸润CD8+ T和NK细胞上的表达及其与功能标志物的关系。
分离HCC患者肿瘤、癌旁正常肝及外周血单个核细胞，流式细胞术检测NKG2A、NKG2C、PD-1表达及CD39、CD103、granzyme B、perforin等功能标志物。
单细胞RNA与TCR测序解析免疫亚群异质性
表征NKG2A、NKG2C和PD-1在不同T和NK细胞亚群中的表达模式及克隆扩增特征。
对SYSU队列3例患者配对肿瘤与正常肝组织的免疫细胞进行单细胞RNA测序和TCR测序，分析免疫亚群比例及NKG2A、NKG2C、PD-1表达分布和克隆型。
体外功能实验评估NKG2A/NKG2C/PD-1阻断效果
验证NKG2A阻断单独或联合PD-1阻断对肿瘤浸润T和NK细胞功能及肿瘤杀伤能力的影响。
TIL在抗CD3/CD28或IL-2条件下培养，加入NKG2A或PD-1阻断抗体（10 µg/mL），流式检测HLA-DR、CD137、granzyme B、perforin、CD107a；HLA-A匹配HCC细胞系与肿瘤浸润免疫细胞共培养，检测活肿瘤细胞计数。
小鼠原位肝肿瘤模型体内验证联合阻断疗效
评估NKG2A和PD-1联合阻断在体内对肿瘤生长和T细胞免疫的增强效果。
C57BL/6小鼠肝内注射Hepa1-6-luciferase细胞建立原位肝肿瘤模型，第7天开始给予抗NKG2A（20D5或16A11）和/或抗PD-1抗体，监测肿瘤荧光通量、体重，终点分析肿瘤浸润T细胞增殖和穿孔素表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫细胞分离 | Ficoll | DAKEWE | 7111012 |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| DNA酶I | Roche | -- | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 含Ca2+和Mg2+的Hanks平衡盐溶液 | Servicebio | G4204-500mL | |
| 细胞过滤 | 70 µm细胞筛网 | Beijing Labgic Technology Co. | 24012637 |
| 40 µm细胞筛网 | Beijing Labgic Technology Co. | 24226131 | |
| 免疫组化 | 抗HLA-E抗体（克隆MEM-E/02） | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 抗HLA-A/B/C抗体（克隆EMR8-5） | Abcam | -- | |
| 抗CD8抗体（克隆C8/144b） | Agilent Technologies | -- | |
| Optiview DAB检测试剂盒 | Roche Diagnostics | -- | |
| Ventana Benchmark ULTRA系统 | Ventana | -- | |
| 体内实验 | 抗NKG2A抗体（克隆20D5） | -- | -- |
| 抗NKG2A抗体（克隆16A11） | -- | -- | |
| 体外阻断实验 | 帕博利珠单抗 | -- | -- |
| 信迪利单抗 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列与样本采集 | SYSU队列：56例HCC患者，手术时间2022年12月至2026年5月，收集肿瘤与配对正常肝组织及外周血；EMC队列：165例HCC患者，手术时间2001–2014年，FFPE组织构建TMA。纳入标准：病理诊断为HCC；术前至少1个月未接受化疗、免疫抑制治疗或靶向治疗；有可用临床病理信息。 阅读提示：Methods-Patients；在线补充材料中临床病理信息 |
| 免疫细胞分离与组织消化 | 组织消化条件：0.125 mg/mL胶原酶IV、0.2 mg/mL DNAse I、1000 units/mL透明质酸酶、5% FBS的HBSS，37°C消化20–30分钟；Ficoll密度梯度离心分离单核免疫细胞；70 µm和40 µm筛网过滤。 阅读提示：Methods-Isolation of immune cells |
| TMA染色与评分 | TMA取3或4个1.0 mm核心；4 µm切片；0.3% H2O2阻断15分钟；微波抗原修复10分钟；HLA-E（MEM-E/02）、HLA-A/B/C（EMR8-5）、CD8（C8/144b）染色；两名独立研究者盲法评分，染色强度0–3分。 阅读提示：Methods-TMA staining and survival analysis；Figure 2O–U legend |
| 体外T细胞和NK细胞功能实验 | TIL培养条件：抗CD3/CD28抗体或IL-2；NKG2A或PD-1阻断抗体浓度10 µg/mL；T细胞功能实验培养4天，NK细胞功能实验培养1天；检测标志物HLA-DR、CD137、granzyme B、perforin、CD107a。 阅读提示：Figure 6 legend；在线补充材料中T cell functional assay和NK cell functional assay详细描述 |
| 小鼠原位肝肿瘤模型与抗体治疗 | C57BL/6小鼠肝内注射Hepa1-6或Hepa1-6-luciferase细胞；肿瘤植入后第7天开始抗体治疗；抗NKG2A抗体（20D5或16A11）和/或抗PD-1抗体；每组n=9；每3–4天监测肿瘤荧光和体重；第12–15天分析TIL。 阅读提示：Figure 7A legend；在线补充材料中animal experiments详细描述 |