肝细胞培养与球体形成
建立并维持不同物种的肝细胞在静态单层、静态球体和灌注球体MPS中的培养，以评估基底功能。
使用来自人、猴、大鼠和犬的原代肝细胞，在三种培养平台中培养14天，定期更换培养基并收集样本。
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在静态和灌注球体培养条件下评估人和动物肝细胞的药物性肝损伤风险
Assessing drug-induced liver injury liabilities in human and animal hepatocytes under static and perfused spheroid culture conditions
实验完整度
高包含体外原代肝细胞3种培养平台、4个物种、多种DILI化合物处理及转录组分析，具备功能与机制验证。
主要模型
人原代肝细胞（Lot No. IIN） 食蟹猴原代肝细胞（Lot No. VRX） Wistar大鼠原代肝细胞（Lot No. JJU） 比格犬原代肝细胞（Lot No. JEO）
重点核对
化合物浓度：CPZ 1, 10, 30 µM；BOS 1, 10, 30, 200 µM；FIAU 1, 10, 30, 100 µM（MPS仅FIAU 100 µM） 处理时间：从培养第6天开始，每2天给药一次，至第12天共4次，第14天结束 培养基更换频率：静态单层和静态球体每2天50%更换；MPS每天更换300 µl 对照：0.2% DMSO溶剂对照 生物学重复：静态单层和静态球体每个条件n=3；MPS每个条件n=2
摘要
药物性肝损伤（DILI）仍是药物开发中的主要挑战，凸显了对可靠体外工具评估肝毒性并改善从动物到人类研究转化的需求。本研究评估了来自人、猴、大鼠和犬的原代肝细胞在静态单层、静态球体以及微流控微生理系统（MPS）中灌注球体培养长达14天的基底功能和DILI敏感性。肝细胞功能和损伤反应通过白蛋白、尿素和肝酶评估。细胞暴露于物种特异性DILI化合物氯丙嗪（CPZ）、波生坦（BOS）和泛昔洛韦（FIAU）。跨平台，人和猴肝细胞比大鼠和犬肝细胞表现出更高的功能稳定性和对DILI化合物的敏感性。CPZ和BOS主要在人肝细胞中诱导细胞毒性，而FIAU产生与已知体内结果一致的物种依赖性效应。微流控MPS相对于静态模型表现出适度改善的肝细胞球体功能，但有限的MPS通量限制了我们在FIAU之外测试药物的能力。总体而言，这些结果表明，整合多物种肝细胞球体在静态和微流控平台中可实现比较性DILI评估，并支持改善临床前到临床的转化。本研究表明，静态原代肝细胞球体为检测物种特异性药物性肝损伤提供了稳健、可扩展且生理相关的平台，基因表达谱比传统功能生物标志物提供更强的机制洞察。通过显示灌注微生理系统在测试的肝细胞制备中可能不会显著优于静态球体，该工作支持一种平衡通量、成本和生物复杂性的实用分层测试策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 不同培养平台（静态单层、静态球体、灌注球体MPS）和物种来源（人、猴、大鼠、犬）的原代肝细胞在基底功能和药物性肝损伤敏感性方面有何差异？
- 核心机制
- CPZ和BOS通过细胞毒性和胆汁淤积机制诱导肝损伤；FIAU的肝毒性依赖于线粒体功能障碍，导致脂肪变性和胆汁淤积。
- 主要证据
- 在静态单层、静态球体和灌注球体MPS中培养人、猴、大鼠和犬原代肝细胞，暴露于CPZ、BOS和FIAU，检测白蛋白、尿素、LDH、AST及基因表达谱。
- 研究意义
- 支持在临床前DILI评估中采用分层测试策略，平衡通量、成本和生物复杂性，并表明基因表达谱比传统功能生物标志物提供更强的机制洞察。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肝功能与损伤标志物检测
评估肝细胞在培养过程中的功能维持和损伤反应。
在培养基中检测白蛋白、尿素、LDH和AST水平，每两天一次，持续14天。
DILI化合物处理与毒性评估
评估物种特异性DILI化合物在静态单层和静态球体中的毒性反应，并在MPS中测试FIAU。
从培养第6天开始，细胞暴露于CPZ、BOS或FIAU，每2天给药一次至第12天，检测功能与损伤标志物。
基因表达谱分析
评估不同平台和物种在培养过程中及FIAU处理后的转录组变化。
从培养第0、4、14天收集RNA，进行RNA测序和差异表达分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | INVITROGRO CP球体接种培养基 | -- | Z990033 |
| 球体培养基补充剂A | -- | Z990035 | |
| TORPEDO抗生素混合物 | -- | Z990000 | |
| INVITROGRO球体维持培养基 | -- | Z990034 | |
| 球体旋转培养基 | -- | Z990032 | |
| I型胶原蛋白 | Corning | CB354249 | |
| Corning Elplasia 96孔板 | Corning | 4442 | |
| HUMIMIC Chip2设备 | TissUse GmbH | -- | |
| 肝功能检测 | E88-129试剂盒 | Bethyl Laboratories | -- |
| Stanbio尿素氮检测 | Fisher Scientific | SB-0580-250 | |
| 肝损伤检测 | LDH检测试剂盒 | Abcam | Ab102526 |
| AST活性试剂盒 | Cayman Chemical Company | 701640 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Direct-zol RNA小量提取试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| NanoDrop 8000分光光度计 | Fisher Scientific | -- | |
| 测序文库制备 | Nextflex Poly-A选择试剂盒 | -- | -- |
| Nextflex Rapid Directional RNA 2.0试剂盒 | -- | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq X+测序仪 | Illumina | 1.5B flowcell |
| 测序质量控制 | DropletQuant分光光度计 | PerkinElmer | -- |
| Advanced Analytical 5200片段分析仪系统 | Agilent | -- | |
| 测序文库定量 | Spectramax M2荧光酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| Picogreen检测 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 液体处理 | Janus Mini液体处理系统 | -- | -- |
| Sciclone NGSx自动化液体处理平台 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代肝细胞培养 | 细胞来源、批次、接种密度和培养基组成 阅读提示：Methods 'Overall experimental design'和'Cell culture methods and drug treatments'，Table S1和S2 |
| 静态球体形成 | Elplasia板类型、每孔微腔数、接种细胞数、离心条件 阅读提示：Methods 'Static spheroid model' |
| 灌注球体MPS培养 | HUMIMIC Chip2设备设置、流速、压力、培养基更换频率 阅读提示：Methods 'Perfused spheroid model' |
| DILI化合物处理 | 化合物浓度范围、处理时间、给药频率、溶剂对照浓度 阅读提示：Methods 'Cell culture methods and drug treatments'，Fig. 1C |
| 功能与损伤标志物检测 | 检测时间点、试剂盒来源和检测方法 阅读提示：Methods 'Biochemical assays' |
| 转录组分析 | RNA提取方法、测序平台、数据过滤标准和差异表达阈值 阅读提示：Methods 'RNA isolation'，'Gene expression library preparation and sequencing'，'Transcriptomic data analysis' |
| 统计分析方法 | 统计检验方法、显著性阈值、重复数 阅读提示：Methods 'Statistical analysis and data availability'，Figure legends |