比较新鲜与慢速冷冻/解冻人卵巢皮质早期卵母细胞的单细胞分析揭示冷冻保存对卵母细胞转录组影响极小

研究问题 与新鲜对照相比，慢速冷冻和解冻过程是否对从人早期卵泡中分离的卵母细胞转录组产生负面影响？ 总结答案 新鲜和冷冻/解冻卵母细胞的转录谱未分别聚类，表明与供者内异质性相比，两组之间差异不可检测。 已知背景 既往研究使用慢速冷冻/解冻人卵巢皮质与新鲜对照的卵泡形态、密度和阶段分布的组织学分析，显示两组之间无差异。过去10年报道的临床病例表明，移植慢速冷冻/解冻和新鲜卵巢皮质在5个月内恢复了正常血清FSH水平和规律月经周期。然而，慢速冷冻和解冻组织导致较低的妊娠率和活产率，尽管无统计学显著性。 研究设计、规模、持续时间 我们利用单细胞RNA测序（scRNAseq）对来自三个供者的尸体卵巢分离的144个人卵母细胞进行分析。 参与者/材料、设置、方法 来自三名健康绝经前供者（16、18和27岁）的人卵巢皮质被切成10×10×1 mm3的方块，并分别进行慢速冷冻和解冻或新鲜处理。首先，使用一种从原始和初级卵泡中分离活卵母细胞的新方法，卵巢皮质方块用McIlwain组织切片机切碎并酶消化。接下来，卵母细胞在解剖显微镜下机械剥离，并单独放入含有裂解缓冲液的孔中用于scRNAseq。裂解的单卵母细胞使用seqWell PlexWell快速单细胞RNA方案进行文库制备。合并文库在NovaSeq6000 Illumina平台上进行150-bp双端测序。总共，我们测序了144个卵母细胞——从三个供者中每个供者新鲜分离24个卵母细胞和慢速冷冻和解冻后分离24个卵母细胞。此外，我们使用苏木精和伊红染色对所有三个供者的新鲜和冷冻/解冻卵巢皮质组织进行了组织学分析，并分析了新鲜和冷冻保存卵巢皮质之间的形态、卵泡密度和卵泡阶段分布差异。 主要结果和偶然性的作用 组织学分析显示条件之间卵泡阶段分布或卵泡形态无差异，新鲜和冷冻/解冻组织中正常卵泡的百分比分别为：供者1为86.7%和91.0%，供者2为91.7%和92.5%，供者3为96.1%和91.1%。新鲜和冷冻/解冻组织中每mm3的卵泡密度分别为：供者1为279.4和235.8，供者2为662.2和553.5，供者3为55.8和71.4。对于供者2和3，新鲜和冷冻/解冻条件之间卵泡密度差异无统计学显著性，而对于供者1有显著性（P=0.017）。新鲜和冷冻/解冻组织中的基质细胞密度分别为：供者1两种条件均为0.014，供者2为0.014和0.016，供者3为0.013和0.014。供者1和供者3中条件之间基质细胞密度无统计学显著性差异，尽管供者2有统计学显著性（P≤0.001）。新鲜和冷冻/解冻卵母细胞的转录谱未分别聚类，表明两组之间差异不显著。然而，在组均值水平上，新鲜和冷冻/解冻卵母细胞之间存在小偏移，且三个供者之间的偏移是平行的。在此比较中，新鲜卵母细胞富集与染色体分离和有丝分裂相关的基因本体术语，而冷冻/解冻卵母细胞富集与创伤反应、cAMP信号和细胞外基质组织相关的术语。 大规模数据 数据集可在Zenodo.org上获得。DOI: https://zenodo.org/records/13224872 局限性、注意事项 在本研究中，由于收集和测序卵母细胞周围体细胞的技术挑战，我们仅测序了从早期卵泡分离的卵母细胞。研究冷冻和解冻后体细胞的转录组变化需要在未来进行研究。此外，我们在解冻后立即构建RNAseq文库，重点关注即时变化。研究在培养中或植入动物模型后较晚时间点表现出的效应可能会揭示冷冻/解冻过程对转录组的额外影响。 发现的更广泛意义 对于青春期前癌症患者和不能延迟癌症治疗的成年患者，唯一临床批准的生育力保存方法是卵巢组织冷冻保存。研究冷冻保存引起的所有阶段卵泡变化对于进一步理解在临床中使用这些组织进行生育力保存的安全性和有效性至关重要。我们的研究是首次分析从早期卵泡收集的单个新鲜和慢速冷冻/解冻人卵母细胞之间的转录组变化。为了实现这一点，我们开发了一种新方法，解离新鲜和冷冻/解冻人卵巢皮质以获得来自早期卵泡的活体裸卵母细胞。我们的发现为使用冷冻保存组织和卵泡进行生育力保存提供了见解。 研究资助/利益冲突 本工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01HD099402资助，Jordan Machlin的生殖生物学职业培训（CTRB）培训基金NIH T32，Andrea Jones的NIH F31-HD106626和NIH T31H-D079342，D. Ford Hannum的NIH T32-GM70449，以及Chan Zuckerberg Initiative Grant CZF2019-002428资助。我们声明无利益冲突。