人前列腺癌队列中KMT9表达与免疫相关转录组分析
评估KMT9α/β在人PCa中的表达、生存关联及可能涉及的免疫相关过程。
分析TCGA-PRAD中52例正常前列腺和500例PCa样本，按Kmt9α中位表达分组进行差异表达和GO富集分析。
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KMT9通过促进PMN-MDSCs浸润和ARG1表达驱动前列腺癌T细胞排斥和功能障碍
KMT9 drives T cell exclusion and dysfunction by promoting PMN-MDSCs infiltration and ARG1 expression in prostate cancer
实验完整度
高含TCGA-PRAD队列、Pten/Trp53/Kmt9α KO小鼠模型、scRNA-seq、ChIP-seq、空间表型、T细胞杀伤及CXCR2/ARG1抑制剂体内验证
主要模型
TCGA-PRAD人前列腺癌队列（500例肿瘤和52例正常组织） Pten/Trp53 KO和Pten/Trp53/Kmt9α KO小鼠前列腺癌模型 Pten/Trp53 KO及Kmt9α KO小鼠前列腺类器官/2D肿瘤细胞 自体/同基因小鼠脾脏T细胞与前列腺肿瘤细胞共培养体系
重点核对
小鼠基因敲除采用10周龄tamoxifen诱导，Ctrl、Kmt9α KO、Pten/Trp53 KO和Pten/Trp53/Kmt9α KO分组，图1E和补充图1E中n分别为14、4、10、10只 SB225002处理：每日给药15天，Ctrl/Pten/Trp53 KO每组n=4，Pten/Trp53/Kmt9α KO n=3至4，检测终点为前列腺重量、PMN-MDSC和CD8a+ T细胞空间分布 numidargistat处理：每日给药15天，Pten/Trp53 KO和Pten/Trp53/Kmt9α KO小鼠每组n=3，检测终点为前列腺重量和arginine水平 T细胞杀伤实验：肿瘤细胞与活化T细胞比例1:6.25，SYTOX Green检测超过4天，每6小时成像，ARG1抑制使用10 µM numidargistat预处理24小时 Transwell趋化实验：骨髓中性粒细胞50万/孔，SB225002为500 nM预孵育30 min，CXCL5为100 ng/ml，迁移1小时
摘要
免疫治疗已成为一种革命性的癌症治疗手段，在临床中显示出显著疗效。然而，由于高度免疫抑制的肿瘤免疫微环境（TIME）阻碍细胞毒性T细胞浸润和活性，其在诸如前列腺癌（PCa）等实体瘤中的疗效仍非常有限。本研究表明，赖氨酸甲基转移酶9（KMT9）调控PCa中免疫抑制性TIME的形成。KMT9调控肿瘤分泌的髓系募集C-X-C趋化因子配体5（CXCL5）等C-X-C基序趋化因子受体2（CXCR2）配体的表达，从而促进免疫抑制性多形核髓系来源抑制细胞（PMN-MDSCs）在肿瘤内浸润。这些变化共同导致细胞毒性T细胞活化降低并被排斥出肿瘤腺体。此外，我们证明KMT9通过调控精氨酸酶1（ARG1）的表达赋予肿瘤细胞对T细胞毒性的抵抗。相应地，KMT9α敲除导致前列腺肿瘤生长抑制，伴随PMN-MDSC募集大幅减少以及细胞毒性T细胞活化和浸润前列腺肿瘤腺体显著增加。综上，我们揭示KMT9是免疫逃逸的调控因子，促进前列腺肿瘤中免疫排斥型TIME。此外，我们的发现确立KMT9作为重编程免疫抑制格局并可能提高当前免疫治疗临床疗效的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KMT9是否以及如何在前列腺癌体内调控肿瘤免疫微环境、PMN-MDSC募集和细胞毒性T细胞排斥与功能。
- 核心机制
- KMT9促进CXCL1/2/3/5等CXCR2配体表达，招募PMN-MDSCs形成围绕肿瘤腺体的屏障并排斥细胞毒性T细胞；同时KMT9调控ARG1表达，降低胞外arginine并损害T细胞杀伤功能。
- 主要证据
- TCGA-PRAD中KMT9α高表达与免疫相关差异基因相关；Pten/Trp53/Kmt9α KO小鼠中CXCL2/5表达下降、PMN-MDSC浸润减少、CD8a+ T细胞进入肿瘤腺体并活化；ChIP-seq显示KMT9α富集于Cxcl2/Cxcl5启动子；T细胞杀伤和ARG1抑制实验支持ARG1介导的免疫抵抗。
- 研究意义
- 研究提出KMT9是前列腺肿瘤免疫逃逸和免疫排斥型TIME的调控因子，并提示KMT9α缺失联合CXCR2抑制或ARG1抑制可增强抑制前列腺肿瘤生长，为开发PCa免疫治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建前列腺特异性Kmt9α敲除及Pten/Trp53/Kmt9α敲除小鼠
在免疫完整小鼠中评估Kmt9α缺失对前列腺肿瘤生长和TIME的影响。
将Kmt9αfl/fl与PSA-Cre-ERT2(Tg/0)及PSA-Cre-ERT2(Tg/0)/Ptenfl/fl/Trp53fl/fl小鼠交配，10周龄tamoxifen处理获得Kmt9α KO和Pten/Trp53/Kmt9α KO小鼠，并分析前列腺重量和生存。
鉴定KMT9依赖性髓系趋化因子表达
验证KMT9是否调控PMN-MDSC募集相关趋化因子。
对Ctrl、Pten/Trp53 KO和Pten/Trp53/Kmt9α KO前列腺进行RNA-seq、qRT-PCR、proteome chemokine array、scRNA-seq和ChIP-seq，检测Cxcl1/2/3/5表达及KMT9α启动子占位。
评估Kmt9α缺失对PMN-MDSC浸润和T细胞空间分布的影响
明确KMT9是否影响免疫抑制细胞募集及细胞毒性T细胞排斥。
分离前列腺CD45+白细胞，采用流式细胞术和28抗体单细胞空间表型分析PMN-MDSCs、ARG1+ PMN-MDSCs、CD8a+ T细胞、CD69+和PD-1+状态及空间距离。
验证PMN-MDSC的免疫抑制功能及CXCR2抑制效果
测试前列腺浸润PMN-MDSCs是否抑制T细胞，并评估CXCR2抑制联合Kmt9α缺失的抗肿瘤效果。
将前列腺PMN-MDSCs与anti-CD3/CD28 beads活化的自体T细胞按1:2共培养3天，检测T细胞增殖和活化；用Transwell趋化实验和SB225002处理小鼠评估CXCR2抑制。
验证KMT9调控ARG1及肿瘤细胞对T细胞杀伤的抵抗
解析KMT9是否通过ARG1影响前列腺肿瘤细胞对T细胞毒性的敏感性。
对Pten/Trp53 KO和Pten/Trp53/Kmt9α KO细胞进行RNA-seq、qRT-PCR和Western blot检测Arg1/ARG1；将肿瘤细胞与自体或同基因活化T细胞共培养，并用numidargistat处理。
评估Kmt9α缺失联合ARG1抑制的体内抗肿瘤效果
验证ARG1抑制是否在Kmt9α缺失背景下进一步增强抗肿瘤反应。
Pten/Trp53 KO和Pten/Trp53/Kmt9α KO小鼠每日接受numidargistat处理15天，检测前列腺重量、arginine水平及CD69+ CD8a+ T细胞和PMN-MDSC空间分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | Precision Plus Protein Kaleidoscope标准品 | Bio-Rad | -- |
| Amersham imager 600成像仪 | GE Healthcare | -- | |
| Mouse chemokine expression profile analysis | Proteome Profiler小鼠趋化因子阵列试剂盒 | R&D systems | -- |
| RNA isolation | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| Quantitative RT-PCR | Abgene SYBR Green PCR试剂盒 | Invitrogen | -- |
| Organoid culture and 2D cell culture | Matrigel基底膜基质 | Corning | 354234 |
| Organoid culture | Advanced DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Organoid generation | TrypLE Express酶（1x） | Gibco | 12605036 |
| 表达Adeno-Cre-GFP的腺病毒 | Vector Biolabs | -- | |
| NLS-KMT9α expression | pLenti-NLS-KMT9α载体 | -- | -- |
| Mouse prostate digestion | MACS C管 | Miltenyi Biotec | -- |
| 小鼠肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| DNase I | Roche | -- | |
| MACS Octo组织解离仪 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CD45+ leukocyte isolation | CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | -- |
| Multiplex staining | PhenoCycler-Fusion系统 | Akoya | -- |
| Leica Apex Superior粘附载玻片 | Leica | 350080 | |
| HistoChoice透明剂 | VWR | H103 | |
| HybriSlides | Grace Biolabs | 714022 | |
| Flow cytometry | TruStain FcX抗小鼠CD16/32抗体 | Biolegend | -- |
| Zombie NIR染料 | Biolegend | -- | |
| eBioscience Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | Invitrogen | -- | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| 抗CD45-AF700抗体 | Biolegend | 103128 | |
| 抗CD11b-APC抗体 | Biolegend | 101211 | |
| 抗Ly6G-Pacific blue抗体 | Biolegend | 127612 | |
| 抗Ly6C-BV785抗体 | Biolegend | 127612 | |
| 抗CD3-BV785抗体 | Biolegend | 127612 | |
| 抗CD4-PerCP Cy5.5抗体 | Biolegend | 100434 | |
| 抗CD25-BV711抗体 | Biolegend | 1102049 | |
| 抗CD8-PE/Dazzle 594抗体 | Biolegend | 100762 | |
| 抗EpCAM-APC抗体 | Biolegend | 118214 | |
| 抗EpCAM-FITC抗体 | Biolegend | 118208 | |
| 抗Granzyme B-PE/Cy7抗体 | Biolegend | 396410 | |
| Zombie NIR-APC Cy7染料 | Biolegend | 423106 | |
| Single-cell isolation and FACS | 抗CD45抗体 | eBioscience | 11-0451-82 |
| 抗CD31抗体 | eBioscience | 11-0311-82 | |
| 抗Ter-119抗体 | eBioscience | 11-592185 | |
| 抗EpCAM抗体 | Biolegend | 118217 | |
| 抗CD49f抗体 | Biolegend | 313611 | |
| DAPI | -- | -- | |
| scRNA-seq | Chromium平台 | 10x Genomics | -- |
| 单细胞3'试剂v2方案 | 10x Genomics | -- | |
| Illumina NovaSeq SP测序通道 | Illumina | -- | |
| LUNA自动细胞计数仪 | Logos Biosystems | -- | |
| ChIP-seq | GammaBind G-Sepharose | GE-Healthcare | -- |
| NovaSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| Multiplexed immunofluorescence analysis | Opal 7色试剂盒 | Akoya Biosciences | -- |
| PhenoImager Fusion成像仪 | Akoya Biosciences | -- | |
| 抗KMT9α抗体 | Schüle Lab | 28445 | |
| 抗PTEN抗体 | CST | 9552S | |
| 抗TP53抗体 | Linaris | LIN-P956 | |
| 抗Ly6G抗体 | CST | 87048 T | |
| 抗ARG1抗体 | CST | 93668 | |
| 抗CD8a抗体 | CST | 98941 T | |
| 抗PD-1抗体 | CST | 84651S | |
| 抗CD69抗体 | Proteintech | 10803-1-AP | |
| PanCK抗体 | NeoBiotech | MSM2-371 | |
| 抗arginine抗体 | antibodies-online.com | ABIN7439879 | |
| T cell suppression assay | Pan T细胞分离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| CellTrace Violet细胞增殖试剂盒 | ThermoFisher | -- | |
| Dynabeads | Invitrogen | -- | |
| MDSC分离试剂盒 | Miltenyi | -- | |
| EVOS FLc成像系统 | Invitrogen | -- | |
| 抗CD69-BV510抗体 | Biolegend | 104532 | |
| T cell cytotoxicity assay | SYTOX Green核酸染料 | Invitrogen | -- |
| Incucyte S3活细胞分析系统 | Sartorius | -- | |
| Mouse neutrophil isolation | 中性粒细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| Transwell chemotaxis assay | 3 µm孔径96孔Transwell板 | Corning | -- |
| 小鼠CXCL5蛋白 | Novus Biologicals | -- | |
| Tissue microarrays analysis | 人前列腺组织芯片 | TissueArray.Com LLC | PR1921c |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗KMT9α抗体 | 抗体编号：228,445，批号27,112,018，来源Schüle Lab，Western blot稀释1/400，免疫组化7.5 μg/ml 阅读提示：核对Methods中Western blot analysis和Haematoxylin and immunohistochemical staining小节。 |
| 抗ARG1抗体 | 抗体编号：Cell Signalling Technology #93,668，批号4，Western blot稀释1/1000 阅读提示：核对Methods中Western blot analysis小节及Supplementary Fig. 6源数据。 |
| 抗CD8a抗体 | 抗体编号：CST 98941 T，批号6，稀释2.5/1000，AR6缓冲液 阅读提示：核对Methods中Multiplexed immunofluorescence analysis小节。 |
| 抗Ly6G抗体 | 抗体编号：CST 87048 T，批号1A8，稀释6.5/1000 阅读提示：核对Methods中Multiplexed immunofluorescence analysis小节。 |
| 抗CD69抗体 | 抗体编号：Proteintech 10,803-1-AP，批号00090170，稀释1/1000 阅读提示：核对Methods中Multiplexed immunofluorescence analysis小节。 |
| SB225002处理 | 抑制剂浓度500 nM用于Transwell预孵育30 min；体内每日处理15天 阅读提示：核对Methods中Transwell chemotaxis assays和Mouse studies小节，以及Supplemental Fig. 3C。 |
| numidargistat处理 | 体外10 µM预处理24 h；体内每日处理15天 阅读提示：核对Methods中T cell suppression and cytotoxicity assays和Mouse studies小节，以及Supplemental Fig. 5B。 |
| T细胞杀伤实验 | 肿瘤细胞:T细胞比例1:6.25，SYTOX Green 10 nM，观察超过4天，每6小时成像 阅读提示：核对Methods中T cell suppression and cytotoxicity assays小节。 |