细胞系易感性评估
筛选对EV-D68感染具有较高生理相关性和复制效率的细胞系。
对RD、H1299、SK-N-SH、Huh-7和HaCaT五种细胞系进行生长动力学检测，通过蚀斑试验和Western blot评估病毒复制。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
GW406108X的临床前评价：一种通过阻断ULK1/2介导的自噬抑制肠道病毒复制的广谱治疗药物
Preclinical evaluation of GW406108X, a broad-spectrum therapeutic blocking ULK1/2-mediated autophagy to inhibit enterovirus replication
实验完整度
高包含RD/H1299细胞、hNEpC原代细胞、小鼠模型等多层证据，并有siRNA敲低、耐药突变、复制子等功能与机制验证
主要模型
RD细胞（横纹肌肉瘤细胞系） H1299细胞（非小细胞肺癌细胞系） P4 C57BL/6乳鼠EV-D68感染模型 hNEpC（人鼻上皮原代细胞）
重点核对
高通量筛选：RD细胞MOI 5、感染后12 h固定；H1299细胞MOI 10、感染后24 h固定；化合物终浓度10 μmol/L；阳性对照20 μmol/L fidaxomicin GW406108X抗病毒活性：EC50为1.804 μmol/L，CC50 > 100 μmol/L，选择性指数 > 55.43 TOA/TOR实验：10 μmol/L GW406108X，时间点2、4、6、8、10 h.p.i.，12 h.p.i.收获 siRNA敲低：ULK1、ULK2、KIF15、RAF1及非靶向对照，25或50 nmol/L，感染MOI 0.1，12 h.p.i.检测 体内药效：P4 C57BL/6乳鼠腹腔注射5或10 mg/kg GW406108X，2 h后鼻内接种1 × 10^7 PFU鼠适应EV-D68 US/MO/14-8949，连续给药5天，监测至感染后17天
摘要
肠道病毒D68（EV-D68）是一种新发呼吸道病原体，重症病例可发展为急性弛缓性脊髓炎，这是一种麻痹性疾病。尽管关注日益增加，目前尚无获批的针对EV-D68的抗病毒药物，凸显了治疗药物发现的迫切需求。在此，我们报道了一种高通量、基于表型的检测方法的开发，用于在两种EV-D68易感细胞系（RD和H1299）上筛选九个多样化化合物库中的7986种化合物以寻找EV-D68抗病毒药物。该筛选鉴定出GW406108X是一种有效的EV-D68感染进入后抑制剂（EC50：1.804 μmol/L）。使用荧光素酶复制子检测、siRNA敲低和耐药突变体生成的机制研究表明，GW406108X通过抑制ULK1/2靶向自噬通路。透射电子显微镜和荧光生物成像显示，在处理过的感染细胞中自噬体形成显著减少。这种破坏可能损害病毒利用自噬的能力，进而可能阻碍复制细胞器形成和非裂解性病毒粒子释放，导致病毒复制减少。临床前评价显示，GW406108X表现出强抗病毒效力且无可检测的细胞毒性。这些发现揭示了一种此前未被表征的抗病毒机制，并将GW406108X定位为抗病毒治疗开发的有前景候选药物。本研究结果扩展了当前肠道病毒的抗病毒格局，代表了向EV-D68及潜在相关病毒病原体临床干预迈出的重要一步。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过高通量表型筛选发现靶向宿主因子、抑制EV-D68复制的广谱抗病毒化合物，并阐明其作用机制及临床前效力。
- 核心机制
- GW406108X通过抑制ULK1/2阻断自噬通路，阻止自噬体形成，从而损害病毒利用自噬进行复制细胞器形成和非裂解性病毒粒子释放，抑制EV-D68复制。
- 主要证据
- 在RD和H1299细胞中筛选7986种化合物发现GW406108X；荧光素酶复制子、siRNA敲低、耐药突变生成、LC3 Western blot、免疫荧光LC3斑点、TEM及小鼠模型验证其靶向ULK1/2并抑制自噬和病毒复制。
- 研究意义
- 扩展了肠道病毒抗病毒格局，将GW406108X定位为有前景的抗病毒先导化合物，为EV-D68及相关病毒病原体的临床干预提供新策略和实验工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高通量表型筛选
从多个化合物库中筛选抑制EV-D68感染的候选化合物。
在RD和H1299细胞上采用免疫荧光检测EV-D68 VP1，筛选九个化合物库共7986种化合物。
候选化合物体外抗病毒验证
验证初筛hit化合物的细胞毒性和进入后抗病毒活性。
对7种化合物进行细胞毒性试验和进入后试验，计算CC50和EC50。
抗病毒谱和细胞系特异性评估
确定GW406108X是否具有广谱抗病毒活性及是否依赖特定细胞系。
在多种细胞系和多种肠道病毒、RV-A16、DENV-2、CHIKV中测定EC50和CC50。
病毒生命周期阶段定位
确定GW406108X作用于病毒复制的哪个阶段。
进行TOA、TOR和进入旁路试验，并通过Western blot和qRT-PCR检测病毒蛋白和RNA。
NanoLuc复制子系统机制解析
区分GW406108X对病毒基因组RNA复制和蛋白翻译的影响。
构建复制 competent 和复制 defective 的EV-D68 NanoLuc replicon，转染H1299细胞后加药检测发光。
耐药突变体生成
判断GW406108X靶向病毒蛋白还是宿主因子。
在递增浓度GW406108X存在下连续传代EV-D68 18次，每5代进行蚀斑试验检测耐药性。
宿主靶点验证
验证GW406108X已知靶点ULK1、ULK2、KIF15、RAF1在EV-D68感染中的作用。
对H1299细胞进行siRNA敲低，检测细胞毒性、敲低效率、病毒滴度和病毒蛋白水平。
自噬抑制验证
验证GW406108X通过抑制自噬影响EV-D68复制。
通过Western blot检测LC3-I/II转化，免疫荧光检测LC3斑点，TEM观察自噬体和DMV形成。
体内毒性和药效评估
评估GW406108X在小鼠模型中的毒性和抗病毒效力。
P4 C57BL/6乳鼠腹腔注射GW406108X，鼻内接种鼠适应EV-D68，监测生存率、体重、临床评分和肺病毒滴度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Cytiva | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 罗斯威尔公园纪念研究所-1640培养基 | Sigma–Aldrich | -- | |
| 气道上皮细胞生长培养基 | PromoCell | -- | |
| Eagle最低必需培养基 | Lonza | -- | |
| 高通量筛选 | FDA批准药物库 | Selleckchem | -- |
| 黄酮类化合物库 | TimTec | -- | |
| 天然产物库 | Enzo Life Sciences | -- | |
| 血管紧张素转换酶2抑制剂库 | TargetMol | -- | |
| RNA靶向化合物库 | Otava | -- | |
| 中药化合物库 | Professor Erwei Hao, Guangxi University of Chinese Medicine | -- | |
| 糖苷库 | MedChemExpress | -- | |
| 肽模拟物库 | MedChemExpress | -- | |
| 激酶抑制剂库 | MedChemExpress | -- | |
| EV-D68 VP1抗体 | GeneTex | -- | |
| 抗兔异硫氰酸荧光素抗体 | Merck Millipore | -- | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Thermo Scientific | -- | |
| Zoom HT高通量微孔板洗板机 | Berthold Technologies | -- | |
| Operetta CLS高内涵成像系统 | Revvity | -- | |
| 病毒蚀斑试验 | 琼脂糖 | Vivantis | -- |
| 羧甲基纤维素 | -- | -- | |
| 1%结晶紫溶液 | Sigma–Aldrich | -- | |
| 进入旁路试验 | QIAmp病毒RNA迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| DharmaFECT 1转染试剂 | Horizon Discovery | -- | |
| 最低必需培养基/Earle平衡盐溶液 | Cytiva | -- | |
| qRT-PCR | 总RNA RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| MMLV逆转录酶 | Promega | -- | |
| 2×引物qRT-PCR混合液 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| FAM5′-NFQ-MGB3′探针 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | Mini-PROTEAN Tetra垂直电泳槽 | Bio-Rad | -- |
| Trans-Blot Turbo转膜系统 | Bio-Rad | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma–Aldrich | -- | |
| 脱脂奶粉 | Nature One | -- | |
| Immobilon Western化学发光辣根过氧化物酶底物 | Merck Millipore | -- | |
| C-DiGit化学发光Western Blot扫描仪 | LI-COR | -- | |
| 兔抗EV-D68 VP1抗体 | GeneTex | -- | |
| 兔抗ULK1抗体 | ABclonal | -- | |
| 兔抗ULK2抗体 | Abcam | -- | |
| 兔抗KIF15抗体 | Proteintech | -- | |
| 兔抗RAF1抗体 | ABclonal | -- | |
| 小鼠抗LC3抗体 | Cell SignalLing Technology | -- | |
| 小鼠抗β-actin抗体 | Sigma–Aldrich | -- | |
| 小鼠抗α-tubulin抗体 | Invitrogen | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG (H + L)，HRP | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 山羊抗兔IgG (H + L)，HRP | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NanoLuc复制子 | pcDNA3.1+载体 | -- | -- |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- | |
| jetPRIME缓冲液 | Polyplus | -- | |
| 盐酸胍 | Sigma–Aldrich | -- | |
| Nano-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 免疫荧光 | 含DAPI封片剂 | ProSciTech | -- |
| 兔抗EV-D68 VP1抗体 | GeneTex | -- | |
| 小鼠和兔抗LC3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 小鼠抗dsRNA抗体 | Absolute Antibody | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG抗体，(H + L) FITC偶联 | Merck Millipore | -- | |
| 山羊抗兔IgG抗体，(H + L) FITC偶联 | Merck Millipore | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG (H + L)二抗，TRITC | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 山羊抗兔IgG (H + L)二抗，TRITC | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Olympus IX-81显微镜 | Olympus | -- | |
| siRNA敲低 | siGENOME SMARTpool siRNA 人ULK1 (8408) | Dharmacon | 8408 |
| siGENOME SMARTpool siRNA 人ULK2 (9706) | Dharmacon | 9706 | |
| siGENOME SMARTpool siRNA 人KIF15 (56992) | Dharmacon | 56992 | |
| siGENOME SMARTpool siRNA 人RAF1 (5894) | Dharmacon | 5894 | |
| 非靶向对照 | Dharmacon | -- | |
| 1×siRNA缓冲液 | Horizon Discovery | -- | |
| DharmaFECT 1转染试剂 | Dharmacon | -- | |
| 透射电子显微镜 | Araldite 502树脂 | -- | -- |
| Leica EM UC6超薄切片机 | Leica | -- | |
| JEM-1400Flash透射电子显微镜 | JEOL Ltd. | -- | |
| 体内实验 | 无菌过滤PBS | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 高通量筛选 | 细胞接种密度2.3 × 10^4 cells/well；RD细胞感染MOI 5、12 h.p.i.固定；H1299细胞感染MOI 10、24 h.p.i.固定；化合物终浓度10 μmol/L；阳性对照20 μmol/L fidaxomicin；hit标准为归一化感染率<50%且细胞核数>1000 阅读提示：Materials and methods 2.4 High-throughput drug screens |
| 体外抗病毒活性验证 | 细胞接种密度2.3 × 10^4 cells/well；感染MOI 1；GW406108X浓度范围及处理时间；CC50和EC50计算基于非线性回归 阅读提示：Materials and methods 2.6 Cytotoxicity assay、2.8 Pre- and post-infection assays；Results 3.3 |
| TOA/TOR实验 | 感染MOI 1；GW406108X浓度10 μmol/L；加药或撤药时间点2、4、6、8、10 h.p.i.；12 h.p.i.收获 阅读提示：Materials and methods 2.9 Time-of-addition (TOA) and time-of-removal (TOR) assays |
| siRNA敲低 | siRNA浓度25或50 nmol/L；反向转染48 h；感染MOI 0.1；12 h.p.i.收获；ULK1和ULK2敲低效率较低 阅读提示：Materials and methods 2.16 Small interfering RNA (siRNA) knockdown assay；Results 3.7 |
| 体内药效评估 | P4 C57BL/6乳鼠；腹腔注射5或10 mg/kg GW406108X；感染前2 h给药，感染后连续5天给药；鼻内接种1 × 10^7 PFU鼠适应EV-D68 US/MO/14-8949；监测至感染后17天 阅读提示：Materials and methods 2.19 In vivo efficacy evaluation；Figure 10 legend |