Brca1敲低4T1细胞系构建与验证
建立Brca1缺陷型TNBC细胞模型以研究PARPi敏感性
设计4条Brca1靶向shRNA，电穿孔转染4T1细胞，嘌呤霉素筛选7天，Western blot验证敲低效率，选择敲低效率最高的shRNA#1克隆用于后续实验。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
光热驱动的序贯免疫治疗克服Brca1缺陷型三阴性乳腺癌对PARP抑制的耐药性
Photothermal-driven sequential immunotherapy overcomes resistance to PARP inhibition in Brca1-deficient triple-negative breast cancer
实验完整度
高包含体外细胞共培养、STING机制验证、原位/远端肿瘤及肺转移小鼠模型和免疫分析多个独立证据层级，并有功能验证。
主要模型
4T1Brca1−KD原位TNBC小鼠模型 MDA-MB-436人乳腺癌细胞 M0/M1样BMDMs与4T1Brca1−KD共培养体系 4T1Brca1−KD远端肿瘤及肺转移模型
重点核对
MPTT温度43°C，10 min，用于体外及体内光热治疗 OL体内剂量500 μg/鼠，aCD47剂量50 μg/鼠，瘤内注射 DLG外相EPC/GDO 34:66 (w/w)，内相EPC/GDO 50:50 (w/w)，外相相变温度41.92°C，内相81.49°C 原位肿瘤模型：1×10^6 4T1Brca1−KD细胞接种BALB/c小鼠左第四乳腺脂肪垫，肿瘤体积>50 mm3建模成功 MPTT激光：808 nm，1.0 W/cm2，10 min，于第0、2、4、6天照射
摘要
三阴性乳腺癌（TNBC）因靶点稀缺和深度免疫抑制微环境而面临严峻临床挑战，亟需创新治疗策略。尽管聚ADP核糖聚合酶抑制剂在BRCA突变肿瘤中利用合成致死性，但其疗效被肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）驱动的免疫抑制所削弱，且现有联合策略未能克服这些耐药屏障。为此，我们设计了一种热响应双层凝胶用于时空协调递送：温和光热治疗重编程TAMs以瓦解免疫抑制微环境，聚ADP核糖聚合酶抑制剂诱导免疫原性肿瘤死亡释放损伤相关分子模式，延迟释放的抗CD47抗体阻断CD47-信号调节蛋白α轴。在Brca1缺陷型TNBC模型中，该策略证明：（1）温和光热治疗激活干扰素基因刺激因子通路触发TAMs复极化，（2）肿瘤来源双链DNA强化抗肿瘤表型，（3）抗CD47抗体通过抗原交叉呈递增强吞噬作用和T细胞激活。因此，该策略通过重塑免疫抑制微环境控制原位/远端肿瘤和肺转移。我们的工作不仅揭示了物理能量介导免疫调节的新机制，还确立了TNBC治疗的范式转变，从经验性药物组合到理性设计的时空级联。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何克服Brca1缺陷型三阴性乳腺癌中TAMs介导的PARP抑制剂耐药和免疫抑制微环境？
- 核心机制
- MPTT通过非经典STING激活（涉及胞质mtDNA）重编程M2样TAMs为M1样表型，PARPi诱导合成致死并释放DAMPs，延迟释放aCD47阻断CD47-SIRPα轴增强吞噬和抗原交叉呈递，形成序贯级联免疫激活。
- 主要证据
- 体外共培养显示MPTT逆转M2极化并恢复OL诱导的DNA损伤，Western blot显示p-STING升高，FCM显示aCD47增强吞噬和抗原交叉呈递；体内原位TNBC模型中DLG(OL@BP-NSs+aCD47)+L实现20%完全缓解、80%60天生存率，M1/M2比值升高244倍，CD8+ T细胞浸润增加5.32倍，远端肿瘤和肺转移结节显著减少。
- 研究意义
- 提出了一种从经验性药物组合转向理性时空级联的TNBC治疗范式，利用FDA批准的脂质材料构建可扩展的原位凝胶系统，通过局部物理干预激活系统性免疫，为免疫冷肿瘤的联合免疫治疗提供了转化框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
OL@BP-NSs制备与DLG构建
构建具有光热响应和序贯释放能力的双层凝胶递送系统
液相剥离法制备BP-NSs，与OL混合暗搅拌负载形成OL@BP-NSs；采用Macrosol技术分别制备外相LG34/66(OL@BP-NSs)和内相LG50/50(aCD47)，通过双筒注射器依次注入水相形成DLG。
体外细胞毒性与温度筛选
确定MPTT温度和OL剂量以选择性杀伤肿瘤细胞并保护巨噬细胞
CCK-8检测不同温度(37-45°C)和OL浓度(0-10 μg/mL)下4T1Brca1−KD、MDA-MB-436、RAW264.7、THP-1等细胞活力，筛选MPTT温度43°C和OL上限5 μg/mL。
共培养体系评估TAM极化与DNA损伤
验证OL@BP-NSs+MPTT对肿瘤细胞诱导的M2极化的逆转及DNA损伤恢复
建立两种序贯共培养模型：预处理模型（肿瘤细胞先处理再与M0 BMDMs共培养）和后处理模型（共培养后再处理），FCM检测BMDMs M1/M2标志物，FCM和CLSM检测γ-H2AX和dsDNA。
STING通路和胞质mtDNA机制验证
探究MPTT激活STING通路的非经典机制
Western blot检测STING和p-STING表达，qPCR检测胞质mtDNA水平，ELISA检测TNF-α、IFN-β、CXCL9、CXCL10分泌。
巨噬细胞吞噬和抗原交叉呈递功能验证
验证aCD47对巨噬细胞吞噬和抗原交叉呈递的增强作用
CFSE标记OL预处理的4T1Brca1−KD细胞与eFluor-670标记的M1样BMDMs共培养，FCM和CLSM检测吞噬；4T1-OVA细胞预处理后与M1样BMDMs共培养，FCM检测H-2Kb-SIINFEKL复合物。
原位TNBC模型治疗及免疫微环境分析
评估DLG(OL@BP-NSs+aCD47)+L的体内抗肿瘤效果和免疫重塑
BALB/c小鼠原位接种4T1Brca1−KD细胞，随机分6组治疗，监测肿瘤体积和生存，第17天取材进行TUNEL、H&E和FCM免疫分析，第10天进行免疫荧光。
远端肿瘤抑制和抗转移免疫记忆评估
评估序贯治疗诱导的系统性抗肿瘤免疫和免疫记忆
建立双侧肿瘤模型仅治疗原发侧，监测远端肿瘤生长；尾静脉注射4T1Brca1−KD细胞挑战，Bouin's固定计数肺转移结节，FCM分析TdLNs中T细胞亚群。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物加载 | 奥拉帕尼 | MedChemExpress | -- |
| 载体合成 | 块状黑磷 | Jiangsu XFNANO Materials Tech Co., Ltd. | -- |
| 凝胶制备 | 甘油二油酸酯 | Nanjing Well Pharmaceutical Group Co., Ltd. | -- |
| 荧光标记 | 二氢卟吩e6 | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd. | -- |
| Alexa Fluor® 790标记AffiniPure™山羊抗小鼠IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-655-146 | |
| 抗体治疗 | 抗小鼠CD47抗体 | Bio X Cell, Inc. | BE0270 |
| 细胞增殖标记 | CellTrace™ CFSE细胞增殖试剂盒 | ThermoFisher Scientific, Inc. | C34570 |
| 细胞标记 | 细胞增殖染料eFluor™ 670 | ThermoFisher Scientific, Inc. | 65-0840-85 |
| 流式分析 | 可固定活力染料780 | BD Biosciences | 565388 |
| 抗小鼠CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | |
| FITC抗小鼠CD45 | BD Biosciences | 553080 | |
| BV421抗小鼠F4/80 | BD Biosciences | 565411 | |
| APC抗小鼠CD86 | BD Biosciences | 558703 | |
| PE抗小鼠CD206 | BD Biosciences | 568273 | |
| PE-Cy7抗小鼠CD3 | BD Biosciences | 552774 | |
| BV510抗小鼠CD4 | BD Biosciences | 563106 | |
| PE抗小鼠CD44 | BD Biosciences | 553134 | |
| Percp/Cy5.5抗小鼠CD62L | BD Biosciences | 560513 | |
| 固定/透化试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| BV650抗小鼠CD11b | BioLegend | 101259 | |
| BV510抗小鼠CD8α | BioLegend | 100752 | |
| PE抗小鼠CD366 (TIM-3) | BioLegend | 134004 | |
| PE抗小鼠CD11c | BioLegend | 117308 | |
| APC抗小鼠I-A/I-E (MHC-2) | BioLegend | 107614 | |
| PE抗小鼠IFN-γ | BioLegend | 505808 | |
| 细胞激活 | 细胞激活混合物 | BioLegend | 423304 |
| 细胞培养 | Leibovitz's L-15培养基 | Gibco | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- | |
| 重组小鼠M-CSF | PeproTech | -- | |
| 脂多糖 | PeproTech | -- | |
| 质粒提取 | 无内毒素质粒大提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 电转染 | Neon™转染系统 | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Psaitong | -- |
| Western blot | 兔抗BRCA1单克隆抗体 | Proteintech | 22362-1-AP |
| 高效液相色谱 | Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪 | Agilent Technologies | -- |
| 动态光散射 | Zetasizer Nano ZS仪器 | Malvern Panalytical | -- |
| 流变学分析 | DHR-2动态剪切流变仪 | TA Instruments | -- |
| 光热成像 | 热成像相机E50 | FLIR Systems | -- |
| IgG定量 | 二辛可宁酸实验 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 活体成像 | Lumina XR成像系统 | Revvity | -- |
| 细胞毒性检测 | CCK-8实验 | APExBIO Technology LLC | K1018 |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Yeasen Biotechnology | -- |
| DNase I | Yeasen Biotechnology | -- | |
| 组织过滤 | 70 μm细胞筛网 | Corning | -- |
| 流式分析 | CytoFlex S流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 共培养 | Transwell系统 | Corning | -- |
| 免疫荧光 | 抗γ-H2AX (Ser139) | BioLegend | 613419 |
| DNA损伤检测 | DNA损伤检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C2035S |
| 共聚焦显微镜 | FV3000共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | -- |
| Western blot | STING抗体 | Proteintech | 19851-1-AP |
| 磷酸化STING (Ser366)抗体 | Cell Signaling Technology | 72971T | |
| β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66240-1-Ig | |
| ELISA | TNF-α酶联免疫吸附试剂盒 | Elabscience | M3063 |
| IFN-β酶联免疫吸附试剂盒 | Elabscience | M0033 | |
| CXCL9酶联免疫吸附试剂盒 | Elabscience | M3077 | |
| CXCL10酶联免疫吸附试剂盒 | Elabscience | M0021 | |
| Fc受体阻断 | 抗CD16/32 | BD Biosciences | 553141 |
| 抗原交叉呈递检测 | 抗H-2Kb-SIINFEKL | Thermo Fisher Scientific | 12-5743-81 |
| TUNEL检测 | TUNEL实验试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1089 |
| 组织切片 | Leica RM2125 RTS切片机 | Leica Biosystems | -- |
| 免疫荧光 | 兔抗iNOS | Abcam | ab28365 |
| 兔抗CD206 | Cell Signaling Technology | 24595T | |
| 兔抗CD8α | Cell Signaling Technology | 98941T | |
| HRP标记山羊抗兔IgG二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 荧光显微镜 | Ts2R荧光显微镜 | Nikon | -- |
| 肺转移固定 | Bouin's固定液 | Sigma–Aldrich, Merck KGaA | -- |
| 组织学成像 | BX53显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DLG制备 | 外相EPC/GDO比例34:66 (w/w)，内相EPC/GDO比例50:50 (w/w)，OL@BP-NSs载药比例2:1 (w/w)，双筒注射器注射顺序和速度 阅读提示：Methods 2.6节及Fig. 2A |
| MPTT参数 | 808 nm激光，功率密度1.0 W/cm2，照射时间10 min，照射时间点第0、2、4、6天，肿瘤温度维持>41.92°C 阅读提示：Methods 2.9节、2.17节及Fig. 2D-E |
| OL和aCD47体内剂量 | OL剂量500 μg/鼠，aCD47剂量50 μg/鼠，瘤内注射体积和方式 阅读提示：Methods 2.17节 |
| 原位TNBC模型建立 | 细胞接种量1×10^6 4T1Brca1−KD细胞，接种部位左第四乳腺脂肪垫，建模成功标准肿瘤体积>50 mm3 阅读提示：Methods 2.4节 |
| 共培养模型设计 | Transwell孔径0.4 μm，肿瘤细胞与BMDMs共培养时间48 h，预处理和后处理模型处理顺序和时长 阅读提示：Methods 2.15节及Fig. 3D |
| 吞噬和交叉呈递实验 | 肿瘤细胞与巨噬细胞比例1:2，aCD47浓度梯度0、2、5、10 μg/mL，处理时间6 h，OL预处理浓度和时间 阅读提示：Methods 2.16节及Fig. 4E-J |
| 免疫分析时间点和样本量 | 第10天免疫荧光每组3只，第17天FCM每组5只，第31天TdLNs分析每组5只，生存分析每组10只 阅读提示：Methods 2.17、2.18、2.20节及图注 |