Molecular architecture responsible for specific inhibition of oncogenic PI3K α mutants by RLY-2608 and STX-478
包含冷冻电镜结构解析（6个复合物，2.84-3.31 Å）、体外激酶活性、细胞活力、Western blot及MD模拟等多层级功能与机制验证
T-47D细胞（PIK3CA H1047R） MCF-7细胞（PIK3CA E545K） SK-BR-3细胞（PIK3CA WT） 293T细胞（用于残基验证） 重组PI3Kα H1047R/E542K/E545K突变体蛋白复合物
冷冻电镜结构分辨率：RLY-2608结合的H1047R为2.84 Å、E545K为3.01 Å、E542K为2.89 Å；STX-478结合的H1047R为3.31 Å、E545K为3.01 Å、E542K为2.86 Å RLY-2608对H1047R单突变PI3Kα的IC50为12.0 nmol/L；STX-478对H1047R单突变PI3Kα的IC50为2.2 nmol/L Western blot处理浓度与时间：T-47D和MCF-7用0、50、100、200、400 nmol/L处理6 h；293T转染后用RLY-2608（2 μmol/L、200、20、2 nmol/L）或STX-478（1 μmol/L、200、40、8 nmol/L）处理48 h 关键口袋残基突变验证：K942E、E1012A、F1002、H940F等突变对抑制剂抑制pAKT(S473)的影响 细胞活力实验：T-47D最大浓度20 μmol/L，MCF-7和SK-BR-3最大浓度625 μmol/L，五倍系列稀释，处理48 h
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得用于冷冻电镜结构解析的高纯度PI3Kα突变体蛋白复合物
将p110α和p85α基因克隆至pFastBac Dual载体，加入N端6×His标签，通过Bac-to-Bac系统制备重组杆状病毒感染Trichoplusia ni HighFive昆虫细胞进行表达，在STX-478（150 nmol/L）或RLY-2608（250 nmol/L）存在下表达，感染后48 h收获细胞，纯化时将洗涤缓冲液NaCl浓度降至150 mmol/L
获得抑制剂结合的PI3Kα突变体复合物的高分辨率结构
将STX-478（300 μmol/L，4°C孵育30 min）或RLY-2608（500 μmol/L，4°C孵育过夜）加入纯化复合物，使用Vitrobot Mark IV制备冷冻电镜载网，在FEI Titan Krios电镜（300 kV，Gatan K3检测器）上采集数据
从采集的冷冻电镜数据中重建高分辨率电子密度图并建立结构模型
使用MotionCor2进行运动校正，CTFFIND 4.0和Gctf确定CTF参数，在CryoSPARC中进行颗粒挑选、2D分类、3D分类、从头重建和局部精修，最终获得2.84-3.31 Å分辨率的电子密度图，将WT结构（PDB ID: 7MYN）刚性对接入密度图，使用eLBOW和PHENIX进行配体建模和精修
评估RLY-2608和STX-478对不同PIK3CA背景癌细胞系的抗增殖活性
将MCF-7、T-47D和SK-BR-3细胞接种于96孔板，过夜贴壁后加入RLY-2608或STX-478处理48 h，加入CCK-8试剂检测450 nm吸光度
验证RLY-2608和STX-478对PI3K/AKT信号的抑制效果及关键口袋残基的作用
T-47D和MCF-7细胞用不同浓度抑制剂处理6 h后裂解，293T细胞转染后处理48 h，检测p-AKT(S473)、AKT、p110α和GAPDH蛋白表达水平
测定抑制剂对PI3Kα突变体的体外抑制活性（IC50）
使用HTRF Kinase Assay试剂盒，纯化的PI3Kα H1047R突变体以EC70浓度（0.25 nmol/L）使用，加入RLY-2608（起始100 μmol/L，10倍系列稀释）或STX-478（起始50 μmol/L，10倍系列稀释），与PIP2底物混合后加入ATP工作缓冲液反应30 min，检测FRET信号
验证抑制剂在PI3Kα突变体中的结合稳定性及突变特异性构象动态
基于X射线结构（PDB ID: 8TSD）构建RLY-2608-WT PI3Kα复合物，使用Gromacs 2021.4进行MD模拟，采用CHARMM36m力场和CGenFF生成配体参数，在310.15 K和1 bar下进行无限制生产运行
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达 | pFastBac Dual载体 | Invitrogen | -- |
| Bac-to-Bac系统 | Invitrogen | -- | |
| 冷冻电镜样品制备 | Vitrobot Mark IV | FEI | -- |
| Quantifoil R1.2/1.3多孔金网 | -- | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | FEI Titan Krios电子显微镜 | FEI | -- |
| Gatan K3直接电子检测器 | Gatan | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ThermoFisher | -- |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | -- | |
| McCoy's 5A培养基 | ThermoFisher | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Yeasen | 20115ES60 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | TargetMol | C0001 | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | |
| BCA检测试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| PVDF膜（0.45 μm） | Merck Millipore | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化AKT (S473)抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗p110α抗体 | Abclonal | -- | |
| HRP标记二抗 | Abcam | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | ThermoFisher | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Dojindo | CK04 |
| 酶标仪 | BioTek | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脂质激酶活性测定 | HTRF激酶检测试剂盒 | Merck | 33-017 |
| EnVision多标记微孔板检测仪 | PerkinElmer | SCR_012163 | |
| 分子动力学模拟 | Gromacs 2021.4 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | 表达时STX-478浓度150 nmol/L；RLY-2608浓度250 nmol/L；感染后48 h收获；洗涤缓冲液NaCl浓度150 mmol/L；N端6×His标签 阅读提示：Methods 2.1 Expression and purification |
| 冷冻电镜样品制备 | STX-478终浓度300 μmol/L，4°C孵育30 min；RLY-2608终浓度500 μmol/L，4°C孵育过夜；样品量3 μL，吸附6 s，两侧印迹4 s 阅读提示：Methods 2.2 Cryo-EM data collection |
| 细胞活力检测 | T-47D最大浓度20 μmol/L五倍系列稀释；MCF-7和SK-BR-3最大浓度625 μmol/L；处理48 h；CCK-8孵育2 h；三次重复 阅读提示：Methods 2.6 Cell viability assay |
| Western blot | T-47D和MCF-7：200,000细胞/孔，抑制剂0、50、100、200、400 nmol/L处理6 h；293T：转染后RLY-2608（2 μmol/L至2 nmol/L）或STX-478（1 μmol/L至8 nmol/L）处理48 h；DMSO≤0.5%；三次独立重复 阅读提示：Methods 2.5 Western blot |
| 脂质激酶活性测定 | PI3Kα H1047R使用浓度0.25 nmol/L（EC70）；RLY-2608起始100 μmol/L，孵育2 h；STX-478起始50 μmol/L，孵育30 min；ATP反应30 min；三次重复 阅读提示：Methods 2.7 Lipid kinase activity |
