临床样本与动物模型分析FGL1与动脉粥样硬化的相关性
验证循环FGL1水平与动脉粥样硬化进展及内皮功能障碍的关联。
检测52例动脉粥样硬化患者和52例健康对照血浆FGL1水平，分析其与SYNTAX评分和CRP的相关性；建立Apoe−/−小鼠高脂饮食模型，检测血浆FGL1动态变化、主动脉血流动力学及内皮FGL1积累和EndoMT标记物。
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肝细胞因子FGL1通过整合素β1介导的内皮-间充质转化驱动内皮损伤和动脉粥样硬化形成
Hepatokine FGL1 drives endothelial injury and atherogenesis via integrin β 1-mediated endothelial-mesenchymal transition
实验完整度
高含患者血浆样本、Apoe−/−小鼠模型、多种内皮细胞系体外实验，并进行了功能验证和机制通路验证。
主要模型
52例动脉粥样硬化患者及52例健康对照血浆样本 雄性Apoe−/−小鼠高脂饮食动脉粥样硬化模型 HUVECs、HAECs和MAECs内皮细胞
重点核对
患者血浆样本：非ASCVD对照52例，ASCVD患者52例，年龄35–65岁，排除空腹血糖≥7.0 mmol/L或HbA1c≥6.5%者。 Apoe−/−小鼠：雄性，20–22 g，高脂饮食16周或12周诱导动脉粥样硬化。 FGL1重组蛋白处理：HUVECs使用50、100、200 ng/mL处理24 h；小鼠静脉注射15 μg/kg，每周一次。 整合素β1阻断抗体P5D2：HUVECs使用10 μg/mL预处理1 h；小鼠静脉注射15 μg/kg，每周一次，共12周。 RGD肽：小鼠静脉注射5 mg/kg，每周两次，共12周。
摘要
动脉粥样硬化由代谢紊乱和内皮功能障碍驱动；然而其发病机制的确切分子机制尚未完全阐明。纤维蛋白原样蛋白1（FGL1）是一种成熟的肝细胞因子，在调节肿瘤发生和代谢功能障碍中起关键作用，而其参与动脉粥样硬化形成尚不清楚。我们的临床和临床前研究揭示，动脉粥样硬化患者和小鼠血浆FGL1水平升高，与动脉狭窄严重程度相关。长期高脂饮食暴露特异性上调肝脏FGL1表达。肝脏FGL1过表达加速动脉粥样硬化，而肝脏特异性敲低减少斑块负荷。外源性给予FGL1加速内皮损伤和动脉粥样硬化进展。机制上，肝脏来源的FGL1通过纤维蛋白原C端结构域Trp225介导与整合素β1的vWFA结构域结合，在血管内皮中积累。这种相互作用促进整合素β1的构象变化和整合素β1/ILK1复合物形成，共同激活FAK/ERK和Smad信号，驱动内皮细胞的转录重编程。通过整合素β1阻断抗体、FGL1中和抗体或RGD肽靶向FGL1-整合素β1轴的治疗干预，在鼠模型中有效减轻内皮损伤和动脉粥样硬化进展。这些发现确立肝脏FGL1作为血管病理生理学的新型内分泌调节因子，突出FGL1-整合素β1轴作为内皮保护和动脉粥样硬化管理的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝细胞因子FGL1是否参与动脉粥样硬化形成，及其驱动内皮损伤的分子机制是什么？
- 核心机制
- 肝脏来源的FGL1通过其FReDs结构域Trp225与内皮细胞整合素β1的vWFA结构域结合，促进整合素β1构象变化及整合素β1/ILK1复合物形成，依次激活FAK/ERK和Smad信号通路，驱动内皮-间充质转化（EndoMT），导致内皮损伤和动脉粥样硬化进展。
- 主要证据
- 临床患者和小鼠血浆FGL1水平升高并与动脉狭窄严重程度相关；肝脏FGL1过表达加速动脉粥样硬化，肝脏特异性敲低减少斑块负荷，外源FGL1逆转敲低保护效应；体外FGL1剂量依赖性诱导HUVECs、HAECs和MAECs发生EndoMT；Co-IP、Pull-down、SPR和Duolink PLA证实FGL1与整合素β1直接结合及Trp225关键作用；整合素β1抗体、FGL1中和抗体和RGD肽在鼠模型中减轻内皮损伤和斑块进展。
- 研究意义
- 研究将FGL1确立为血管病理生理学的新型内分泌调节因子，提示血浆FGL1可作为早期动脉粥样硬化诊断生物标志物，FGL1–整合素β1轴可作为内皮保护和动脉粥样硬化管理的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
肝脏FGL1过表达和敲低对动脉粥样硬化的功能验证
验证肝脏来源FGL1在动脉粥样硬化进展中的因果作用。
使用AAV8-TBG-Fgl1或AAV8-TBG-shFgl1载体分别过表达或敲低小鼠肝脏FGL1，检测血浆FGL1、主动脉EndoMT、斑块负荷、坏死核心和胶原沉积；外源给予重组FGL1蛋白验证逆转效应。
体外验证FGL1诱导内皮细胞EndoMT
确认FGL1对内皮细胞表型、屏障功能和细胞骨架的直接作用。
用不同浓度FGL1处理HUVECs、HAECs和MAECs，检测细胞形态、F-actin重构、增殖、胶原分泌、通透性和EndoMT标记物及转录因子表达。
验证FGL1与整合素β1的相互作用及ILK1依赖的激活机制
明确FGL1是否直接结合并激活内皮整合素β1，以及ILK1在其中的作用。
通过Western blot检测FGL1处理后整合素β1磷酸化动态；Co-IP验证FGL1与整合素β1相互作用；Duolink PLA检测整合素β1与ILK1相互作用；siRNA敲低ILK1后检测整合素β1激活。
解析FGL1下游FAK/ERK和Smad信号通路
确定FGL1诱导EndoMT的细胞内信号级联顺序。
Western blot检测FGL1处理后FAK、ERK1/2、Smad2/3磷酸化及Smad4核转位；使用FAK抑制剂GSK2256098、MEK抑制剂PD98059和ALK抑制剂SB431542进行药理学干预；体内检测主动脉内皮FAK/ERK/Smad激活。
鉴定FGL1与整合素β1结合的关键位点
确定FGL1与整合素β1相互作用的关键氨基酸残基。
通过分子对接分析预测FGL1的Trp225与整合素β1的vWFA结构域结合；构建FGL1W225A突变体和ITGB1K368A突变体；Co-IP、Pull-down和SPR验证结合能力；检测突变体对下游信号和EndoMT的影响。
靶向FGL1–整合素β1轴在体内验证治疗效果
评估整合素β1抗体、RGD肽和FGL1中和抗体对动脉粥样硬化进展的治疗效果。
在Apoe−/−小鼠高脂饮食12周模型中，分别给予整合素β1抗体、RGD肽或FGL1中和抗体，检测血浆FGL1、内皮FGL1积累、整合素β1激活、EndoMT标记物、主动脉血流动力学、斑块负荷、坏死核心和胶原沉积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA | 人FGL1 ELISA试剂盒 | Cusbio | CSB-EL008653HU |
| CRP ELISA试剂盒 | Proteintech | KE00004 | |
| 小鼠FGL1 ELISA试剂盒 | Cusbio | CSB-EL008653MO | |
| 血清生化分析 | 全自动生化分析仪 | Hitachi | 7180 |
| 动脉粥样硬化模型 | 重组FGL1蛋白 | R&D Systems | 10285-HE-050 |
| FGL1抗体 | Bio X Cell | BE0332 | |
| 整合素β1抗体 | R&D Systems | MAB17781 | |
| RGD肽 | MCE | HY-P1740A | |
| 组织固定 | OCT包埋剂 | Sakura | 4683 |
| 油红O染色 | 油红O | Sigma | O0625 |
| 免疫荧光染色 | DAPI | Beyotime | C1006 |
| Transwell通透性实验 | 辣根过氧化物酶 | Beyotime | A0308 |
| TMB显色底物溶液 | Beyotime | P0206 | |
| TMB终止液 | Beyotime | P0215 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀试剂盒（Protein A/G磁珠） | Beyotime | P2179S |
| Pull-down | Pierce Pull-Down PolyHis蛋白试剂盒 | Thermo Scientific | 21277 |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Life Technologies | 15596018 |
| ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒 | TOYOBO | FSQ-101 | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | TOYOBO | QPK-201 | |
| 胶原含量测定 | Sircol可溶性胶原检测试剂盒 | Biocolor | S1000 |
| 免疫荧光染色 | Triton X-100 | Biosharp | BS084 |
| Duolink PLA | Duolink邻位连接实验试剂盒 | Sigma-Aldrich | DUO921012 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Lonsera | S711-001 |
| 青霉素/链霉素 | Haigene | S0198 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 |
| 磁珠 | Beyotime | FMS012 | |
| 肝组织胆固醇和甘油三酯测定 | 胆固醇检测试剂盒 | Solarbio Life Science | BC1985 |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Solarbio Life Science | BC0625 | |
| 组织学染色 | 改良Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1346 |
| 组织固定 | Davidson固定液 | Solarbio | G2340 |
| 细胞信号通路抑制 | GSK2256098 | Topscience | T2281 |
| PD98059 | Topscience | T2623 | |
| SB431542 | Topscience | T1726 | |
| 细胞培养 | 重组FGL1蛋白 | R&D Systems | 10285-HE |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 患者和对照数量各52例；年龄35–65岁；排除空腹血糖≥7.0 mmol/L或HbA1c≥6.5%；无他汀使用史；血浆离心条件3000×g，15 min。 阅读提示：回看Materials and methods 2.1 Human blood samples and ethics statement；Table 1。 |
| Apoe−/−小鼠动脉粥样硬化模型建立 | 雄性Apoe−/−小鼠，20–22 g；高脂饮食配方（63.6%基础饲料，20%蔗糖，15%猪油，1.2%胆固醇，0.2%胆酸钠）；喂养时间16周或12周；随机分组。 阅读提示：回看Materials and methods 2.2 Mice, antibody, peptide, recombinant protein, virus and virus infection；Figure 1F。 |
| 肝脏FGL1过表达和敲低 | AAV8-TBG-Fgl1或AAV8-TBG-shFgl1载体构建和注射；空载体作为阴性对照；处理4周后检测。 阅读提示：回看Materials and methods 2.2；Results 3.2和3.3；Figure 2A和Figure 3A。 |
| FGL1重组蛋白和抗体体内给药 | FGL1重组蛋白15 μg/kg，静脉注射，每周一次；FGL1抗体15 μg/kg，静脉注射，每周一次；整合素β1抗体15 μg/kg，静脉注射，每周一次；RGD肽5 mg/kg，静脉注射，每周两次；给药时长12周。 阅读提示：回看Materials and methods 2.2；Figure 3A、Figure 6E、Figure 9A、Figure 9H和Figure 10A。 |
| 体外FGL1处理内皮细胞 | HUVECs、HAECs、MAECs来源；FGL1浓度50、100、200 ng/mL；处理时间24 h；TGFβ1 10 ng/mL作为阳性对照；细胞传代数3–8代。 阅读提示：回看Materials and methods 2.10 Cell culture；Figure 4A和Figure 4F。 |
| 信号通路抑制剂处理 | GSK2256098 0.5 μmol/L预处理1 h；PD98059 30 μmol/L预处理1 h；SB431542 1 μmol/L；整合素β1抗体10 μg/mL预处理1 h。 阅读提示：回看Materials and methods 2.10；Results 3.6；Figure 6B和Figure 6C；Figure 7A。 |
| FGL1与整合素β1结合位点验证 | FGL1W225A和ITGB1K368A突变体构建；SPR检测FGL1浓度31.25–500 nmol/L，KD=4.15×10−12 mol/L；Pull-down使用His标签FGL1和Flag标签ITGB1。 阅读提示：回看Results 3.8；Figure 8；Supporting Information Fig. S9和S10。 |