建立顺铂耐药UM细胞系及体内模型
获得并验证顺铂耐药UM模型，为后续机制研究提供基础。
对92.1和OMM2.3细胞进行递增顺铂暴露3个月，建立耐药细胞系；通过IC50、克隆形成、Transwell、伤口愈合及小鼠眼内原位异种移植模型验证耐药表型。
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Elesclomol介导的铜死亡通过限制表观遗传激活的线粒体呼吸克服顺铂耐药：顺铂-elesclomol联合治疗的新治疗见解
Elesclomol-mediated cuproptosis overcomes cisplatin resistance by restricting epigenetically activated mitochondrial respiration: Novel therapeutic insights into cisplatin-elesclomol combination therapy
实验完整度
高体外耐药细胞系、多组学、CRISPR敲除、斑马鱼、原位移植瘤和PDX模型，含功能与机制验证
主要模型
92.1和OMM2.3顺铂耐药及亲本UM细胞系 FDX1敲除的顺铂耐药UM细胞 BALB/c nude小鼠眼内原位异种移植瘤 顺铂耐药患者来源异种移植瘤PDX#1、#2、#6、#7 斑马鱼胚胎异种移植模型
重点核对
顺铂耐药细胞系的IC50值及体外诱导耐药时间（3个月） FDX1敲除的sgRNA序列及Western blot验证效率 elesclomol处理浓度（体外0、1、5、10 nmol/L；斑马鱼5、10 μmol/L；小鼠25 mg/kg静脉注射） PDX模型中顺铂（3 mg/kg腹腔注射，每周3次，21天）和elesclomol（25 mg/kg静脉注射，每周3次）的给药方案 多组学数据登录号：GSE271497、OEZ017533、GSE271539及CUT&Tag重复数
摘要
化疗耐药仍然是癌症治疗中的重大挑战，显著限制了治疗效果。铜死亡是由线粒体蛋白聚集和代谢功能障碍驱动的铜诱导细胞死亡。然而，铜死亡在化疗耐药中的作用仍然是个谜。本研究揭示，表观遗传重塑增强了线粒体呼吸，从而使顺铂耐药性葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞对elesclomol诱导的铜死亡敏感。首先，我们建立了顺铂耐药UM细胞系，并在体外和体内进行了验证。包括转录组学、代谢组学和组蛋白乙酰化谱（H3K9Ac/H3K27Ac CUT&Tag）在内的多组学分析显示，由于组蛋白乙酰化的变化，顺铂耐药细胞中线粒体呼吸上调而糖酵解下调。这种代谢重编程与对elesclomol介导的铜死亡敏感性增加相关，其特征是Fe-S簇蛋白减少和DLAT聚集。我们的研究进一步阐明，FDX1的缺失不仅减弱了化疗耐药UM细胞对elesclomol的敏感性，还减弱了铜诱导的细胞死亡，从而证实了铜死亡在此背景中的关键作用。在治疗方面，利用斑马鱼模型、原位异种移植和患者来源异种移植（PDX），我们证实了elesclomol克服化疗耐药的治疗效果。总之，我们的研究强调了开发顺铂和elesclomol联合治疗策略以改善化疗结果的新途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 铜死亡是否参与葡萄膜黑色素瘤顺铂耐药，以及elesclomol能否通过诱导铜死亡克服顺铂耐药？
- 核心机制
- 表观遗传重塑（组蛋白H3K9ac/H3K27ac上调）激活线粒体呼吸相关基因表达，导致代谢从糖酵解向线粒体呼吸转变，使顺铂耐药UM细胞对elesclomol诱导的FDX1依赖性铜死亡敏感。
- 主要证据
- 在顺铂耐药UM细胞系、FDX1敲除细胞、斑马鱼异种移植、小鼠原位异种移植和PDX模型中，elesclomol处理导致Fe-S簇蛋白减少、DLAT聚集、线粒体呼吸抑制，并显著抑制肿瘤生长；FDX1敲除降低elesclomol敏感性。
- 研究意义
- 本研究提出elesclomol作为克服UM化疗耐药的有前景治疗策略，为常规化疗难治性UM患者提供了新的联合治疗途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多组学分析揭示代谢重编程
探究顺铂耐药UM细胞的代谢特征及表观遗传基础。
对92.1亲本和耐药细胞进行RNA-seq、靶向LC-MS/MS代谢组学、H3K9ac/H3K27Ac CUT&Tag、ChIP-qPCR及Seahorse OCR/ECAR检测。
验证elesclomol对耐药细胞的敏感性及铜死亡机制
明确elesclomol是否通过铜死亡选择性杀伤顺铂耐药细胞，并验证FDX1的作用。
在顺铂耐药和亲本细胞中检测elesclomol的IC50、克隆形成；通过Western blot、免疫荧光检测DLAT聚集和Fe-S簇蛋白；利用CRISPR/Cas9敲除FDX1后评估elesclomol敏感性。
体内验证elesclomol克服顺铂耐药
在动物模型中评估elesclomol单药及联合顺铂的疗效。
使用斑马鱼胚胎异种移植、小鼠眼内原位异种移植和顺铂耐药PDX模型，给予elesclomol或联合顺铂，检测肿瘤负荷、重量及DLAT聚集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| CRISPR/Cas9基因敲除 | Cas9编码慢病毒 | Genomditech | -- |
| FDX1 sgRNA | Genomditech | -- | |
| Polyjet转染试剂 | SignaGen | -- | |
| 聚凝胺 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| Western blot | Actin抗体 | Sangon Biotech | -- |
| 硫辛酸抗体 | Abcam | -- | |
| FDX1抗体 | Proteintech | -- | |
| LIAS抗体 | Proteintech | -- | |
| ACO-2抗体 | Proteintech | -- | |
| SDHB抗体 | Proteintech | -- | |
| POLD1抗体 | Proteintech | -- | |
| H3K9ac抗体 | Proteintech | -- | |
| H3K27ac抗体 | Proteintech | -- | |
| H3抗体 | Proteintech | -- | |
| 免疫荧光 | 线粒体追踪探针 | Thermo Fisher | -- |
| 生物能量分析 | XFe 96细胞外流量分析仪 | -- | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | -- | -- | |
| CUT&Tag | H3K9ac抗体 | Proteintech | -- |
| H3K27ac抗体 | Proteintech | -- | |
| 斑马鱼异种移植 | CM-Dil荧光染料 | Invitrogen | -- |
| 克隆形成 | 结晶紫 | -- | -- |
| 平板扫描仪 | Hewlett-Packard | -- | |
| 小鼠眼内注射 | 33G钝头针 | Hamilton | -- |
| 红霉素眼膏 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 顺铂耐药细胞系建立 | 亲本细胞系（92.1、OMM2.3）、顺铂递增暴露时间（3个月）、耐药后IC50值、维持用顺铂亚治疗浓度、耐药表型再评估时间点。 阅读提示：Methods 2.2节及Results 3.1节，Fig. 1B和1C。 |
| 多组学及表观遗传分析 | RNA-seq平台（Illumina Novaseq 6000）及登录号GSE271497；代谢组学LC-MS/MS登录号OEZ017533；CUT&Tag抗体稀释（H3K9ac/H3K27ac 1:500）、重复数（n=2）、登录号GSE271539；ChIP-qPCR引物设计及靶基因。 阅读提示：Methods 2.7、2.9、2.10、2.11节及Results 3.2、3.5节，Fig. 2、Fig. 6，Supporting Information Table S1和S3。 |
| elesclomol体外敏感性及铜死亡检测 | elesclomol处理浓度（0、1、5、10 nmol/L）、处理时间、FDX1敲除sgRNA序列、Western blot抗体稀释度、免疫荧光DLAT聚集定量方法。 阅读提示：Methods 2.3、2.4、2.5节及Results 3.3、3.4节，Fig. 4、Fig. 5，Supporting Information Table S1。 |
| 小鼠原位异种移植及PDX治疗实验 | 小鼠品系（5周龄雄性BALB/c nude）、细胞注射量及部位（眼内脉络膜上腔）、顺铂给药方案（3 mg/kg，腹腔注射，每周3次，21天）、elesclomol给药方案（25 mg/kg，静脉注射，每周3次）、联合组分组、每组样本量（原位移植n=5，PDX n=4）、肿瘤体积及体重记录频率。 阅读提示：Methods 2.12、2.13节及Results 3.1、3.3、3.6节，Fig. 1H–M、Fig. 4I–L、Fig. 7A–B。 |
| 斑马鱼异种移植 | 斑马鱼品系Tg(kdrl:egfp)、胚胎发育阶段（2 dpf）、注射部位（卵黄囊）、elesclomol浓度（5和10 μmol/L）、每组胚胎数（n=20）、荧光定量方法。 阅读提示：Methods 2.14节及Results 3.3节，Fig. 4F–H。 |