样本收集与处理
获取人类中枢和外周神经系统组织及CSF样本，用于tau亚型分析。
收集死后脑组织（AD、ALS、对照）、脊髓、外周神经（坐骨神经、臂丛、背根神经节）及CSF样本；组织匀浆、离心、sarkosyl处理。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Big Tau亚型在人类中枢和外周神经系统中的分布
Distribution of Big Tau Isoforms in the Human Central and Peripheral Nervous System
实验完整度
高多层级验证：MS测序、IP-PRM定量、免疫印迹、IsoSeq及CSF队列分析，含机制与功能验证。
主要模型
人死后脑组织（AD、ALS、对照） 人脊髓及外周神经组织（坐骨神经、臂丛、背根神经节） 人脑脊液（CSF）样本
重点核对
人脑组织（AD、ALS、对照）和外周神经样本的来源、分组及n数 免疫沉淀用抗体组合（Tau-1、HJ8.5、HJ8.7）及用量 质谱分析中使用的色谱柱、梯度、分辨率等参数 CSF队列的淀粉样蛋白状态和CDR分组及cutoff值 IsoSeq测序的脑区、样本数及分析流程
摘要
目的：Tau在神经退行性疾病中被广泛研究，但大多数工作聚焦于经典脑tau亚型。一种更长的亚型“big tau”由外显子4a插入产生，表达于外周神经系统（PNS）和中枢神经系统（CNS）区域。我们试图表征big tau的组成、解剖分布和疾病相关性。方法：采用质谱（MS）对big tau进行测序并绘制其在人类神经系统中的分布。死后样本包括阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化（ALS）和对照的脑组织；脊髓和外周神经。还在对照和按淀粉样蛋白状态及认知障碍分层的参与者的脑脊液（CSF）中定量了big tau和经典（“small”）tau亚型。结果：人类big tau由外显子4a-long和外显子4a-short分别编码的355或251个氨基酸插入产生。外显子2、3和10的可变剪接产生多种big tau亚型。脑内总tau水平约比PNS高1,000倍；然而，big tau的相对丰度从CNS到PNS增加，占外周总tau的50%，占脑内约1%，主要定位于小脑。在CSF中，big tau水平不因淀粉样蛋白异常或认知障碍而改变，而经典tau随AD病理增加。解释：Big tau代表一种独特的tau群体，富集于PNS，并与脑源性tau的疾病相关变化解耦，提示区分big tau与经典tau可能改善tau生物标志物的解读，并有助于区分CNS神经退行性变与外周神经病理。ANN NEUROL 2026;100:709–736
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类big tau亚型的分子组成、解剖分布及其在神经退行性疾病中的相关性是什么？
- 核心机制
- 外显子4a（主要为4a-L）插入外显子4和5之间，产生big tau；外显子2、3和10可变剪接进一步生成多种亚型。
- 主要证据
- 通过MS鉴定外显子桥接肽，免疫印迹检测HMW tau，IsoSeq确认转录本，IP-PRM定量显示big tau从脑（~1%）到PNS（~50%）梯度增加，CSF中big tau不随AD病理改变。
- 研究意义
- 区分big tau与经典tau可能改善tau生物标志物的解读，并有助于区分CNS神经退行性变与外周神经病理。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
质谱鉴定big tau序列
确定人类big tau的氨基酸序列及外显子4a插入形式。
对脑、脊髓、坐骨神经匀浆进行bottom-up串联质谱，使用自定义数据库搜索外显子4a-L和4a-S序列，鉴定外显子桥接肽。
免疫印迹验证HMW tau
验证big tau蛋白在高分子量条带中的表达。
使用Tau-1和Tau-5抗体对CNS和PNS组织裂解物进行免疫印迹，检测HMW（~115-90 kDa）和LMW（~65-40 kDa）tau条带。
IP-PRM定量tau亚型分布
定量big tau和small tau肽段在神经系统中的相对丰度。
使用抗体混合物（Tau-1, HJ8.5, HJ8.7）免疫沉淀tau，胰蛋白酶消化，加入AQUA内标肽，LC-MS/MS定量29种以上肽段。
IsoSeq分析big tau转录本
确认成人脑内big tau转录本表达。
对10名对照脑供体的尾状核和额中回进行长读长IsoSeq测序，分析MAPT转录本。
CSF tau亚型定量及临床关联分析
评估CSF中big tau和small tau水平与AD病理及认知的关系。
对CSF进行tau免疫沉淀和PRM-MS定量，分析big tau（外显子4a-L/6）和small tau（0N）肽段，与淀粉样蛋白状态、CDR、MMSE等关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织匀浆 | 磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Fisherbrand Model 120 超声破碎仪 | Fisherbrand | -- | |
| Eppendorf Centrifuge 5424R 离心机 | Eppendorf | -- | |
| Beckman Optima TLX 超速离心机 | Beckman | -- | |
| 免疫印迹 | 4X LDS 上样缓冲液 | Bio-Rad | -- |
| 二硫苏糖醇 | Pierce | A39255 | |
| NuPAGE Bis-Tris 小型蛋白凝胶 | Invitrogen | NP0322 | |
| PVDF膜 | Immobilon | IPVH00010 | |
| Tau-1 抗体 | -- | -- | |
| Tau-5 抗体 | Chemicon | MAB361 | |
| GAPDH 抗体 | Invitrogen | MA5-15738 | |
| β-actin 抗体 | Cell Signaling Technology | 13E5 | |
| 山羊抗小鼠 IgG-HRP | Invitrogen | A28177 | |
| 山羊抗兔 IgG-HRP | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| West Pico PLUS 化学发光底物 | SuperSignal | 34580 | |
| West Atto 超敏底物 | SuperSignal | A38554 | |
| SDS-PAGE与胶内消化 | Oriole 荧光凝胶染色 | Bio-Rad | 1610496 |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| 免疫沉淀 | HJ8.5 抗体 | -- | -- |
| HJ8.7 抗体 | -- | -- | |
| Sepharose 珠 | -- | -- | |
| 质谱分析 | Vanquish Neo 超高效液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Exploris 480 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HSS T3 色谱柱 | Waters | -- | |
| Orbitrap Tribrid Eclipse 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IsoSeq | SuperScript IV 第一链合成系统 | ThermoFisher Scientific | 18091200 |
| TaKaRa LA Taq DNA聚合酶（含GC缓冲液） | Clontech | RR02AG | |
| AMPure PB 磁珠 | PacBio | -- | |
| SMRTbell Express 模板制备试剂盒3.0 | PacBio | -- | |
| PacBio Sequel II 测序平台 | PacBio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人组织样本收集 | 脑组织来自ADRC，n=62；脊髓和外周神经n=35；CSF n=90；分组包括AD、ALS、对照及淀粉样蛋白状态。 阅读提示：Methods: Human Tissue Samples and CSF；Table 1, Table 2, Table 3 |
| 免疫沉淀 | 抗体组合Tau-1、HJ8.5、HJ8.7比例；组织蛋白量50 μg，CSF体积0.5 ml；孵育2小时室温。 阅读提示：Methods: Soluble Tau Quantitation in Human Tissues and CSF |
| 质谱分析 | 色谱柱HSS T3；流速0.4 μl/min；梯度；Orbitrap Exploris 480分辨率设置。 阅读提示：Methods: Mass Spectrometry |
| CSF淀粉样蛋白状态分类 | Aβ42/40比值cutoff 0.11；CDR分组标准。 阅读提示：Methods: Human Tissue Samples and CSF；Table 3 |
| IsoSeq | 脑区：尾状核和额中回，各n=5；RNA量100 ng；测序平台PacBio Sequel II。 阅读提示：Methods: MAPT Targeted IsoSeq；Supplementary Table S3 |