患者入组与缺血/非缺血血样采集
获取大血管闭塞卒中患者闭塞大脑中动脉远端缺血血和配对非缺血动脉血，以分析超急性局部免疫反应。
前瞻性纳入54例大脑中动脉大血管闭塞急性缺血性卒中患者，在机械取栓术中经微导管从血栓远端闭塞段采集约500 μL缺血血，导管回撤时从同侧颈内动脉或主动脉采集非缺血动脉血；部分患者另取外周静脉血，并采集10例非卒中诊断性血管造影患者颈内动脉血作为对照。
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大血管闭塞卒中患者脑循环中超急性白细胞介素-1β产生与中性粒细胞胞外诱捕网形成
Hyperacute Interleukin-1β Production and Neutrophil Extracellular Trap Formation in the Cerebral Circulation of Stroke Patients with Large Vessel Occlusion
实验完整度
高多组学患者血液、血浆细胞因子/代谢物、体外NET诱导、尸检脑组织免疫荧光，含功能验证。
主要模型
54例大血管闭塞急性缺血性卒中患者行机械取栓，获取闭塞大脑中动脉远端缺血血与配对非缺血动脉血 10例非卒中诊断性血管造影患者颈内动脉动脉血对照 健康供者外周静脉血中性粒细胞体外NETosis诱导模型 3例大脑中动脉闭塞后尸检脑组织标本
重点核对
缺血血与配对非缺血动脉血的同个体内比较，部分分析加入静脉血和非卒中动脉血对照 患者分组样本量：细胞因子分析n=29、NETosis分析n=33、ATP分析n=10；部分患者组A/B重叠n=18 离体全血再刺激条件：脂多糖1.25 μg/ml和干扰素-γ 100 ng/ml 8小时；ATP 2.5 mmol/l 30分钟 血浆细胞因子/趋化因子检测：U-Plex Custom Biomarker Assay及CitH3 ELISA；NET标志物包括胞外DNA和CitH3 体外NETosis诱导：健康供者中性粒细胞2×10^5/孔，10%患者血浆刺激4小时，并用IL-1RA 1 ng/mL中和IL-1β
摘要
目的：脑缺血仍是致残的主要原因，超急性免疫反应的作用日益受到认识。本研究旨在探讨大血管闭塞卒中患者超急性期受累脑局部的炎症反应。方法：为解析髓系免疫细胞在卒中诱导炎症中的作用，我们对54例接受机械再通患者直接从闭塞大脑中动脉获取的缺血血液中先天免疫通路进行了无监督多组学分析。配对的非缺血动脉血作为内对照。结果：卒中触发缺血脑血管内经典单核细胞和中性粒细胞的局部超急性激活，白细胞介素（IL）-1β成为炎症的关键介质。血浆腺苷三磷酸水平升高及血管内单核细胞的炎性小体启动与卒中发病4.5小时内闭塞大脑中动脉内IL-1β产生相关。IL-1β释放与中性粒细胞趋化因子（C-X-C基序趋化因子配体1[CXCL1]、IL-8）增加同时发生。局部激活的中性粒细胞在缺血血管内形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），这是血栓炎症的标志。尸检分析显示缺血脑实质内有NET沉积。解读：这些发现表明，大血管闭塞所致卒中患者脑循环内IL-1β表达增加、NET形成增强，提示这些机制可能参与早期卒中病理生理过程，并可能成为免疫调节策略的潜在靶点。ANN NEUROL 2026;100:824–840。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 大血管闭塞急性缺血性卒中患者超急性期，闭塞大脑中动脉供血区域脑循环内是否存在局部先天免疫激活及炎症反应。
- 核心机制
- 卒中后缺血血管内单核细胞炎性小体启动并产生IL-1β，伴随ATP升高和中性粒细胞趋化因子增加，局部激活中性粒细胞形成NETs；离体实验提示IL-1β信号与NET形成相关，但研究为观察性，不能建立机制因果。
- 主要证据
- 54例机械取栓患者缺血血与配对非缺血动脉血的多组学、血浆细胞因子/ATP/CitH3/胞外DNA分析显示局部IL-1β、IL-1RA、CXCL1、IL-8、ATP和NET标志物升高；单核细胞ASC斑点增加；离体缺血血浆诱导健康供者中性粒细胞形成NETs；尸检脑组织显示CitH3、MPO、NE共定位的NET结构。
- 研究意义
- 这些发现提示IL-1β表达增加和NET形成可能参与大血管闭塞卒中的早期病理生理过程，并可能作为免疫调节策略的潜在靶点；作者提出需进一步研究以明确机制及治疗相关性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞多组学分析缺血血免疫细胞组成与激活
比较缺血血与非缺血动脉血中免疫细胞组成和单核细胞激活/细胞因子表达特征。
从全血分离PBMC并使用TotalSeq-C Human Universal Cocktail染色，构建Chromium Single Cell 5′文库，Illumina NovaSeq测序；使用Seurat、SingleR和MonacoImmuneData注释细胞类型，过滤单核细胞、B细胞、T细胞、NK细胞和树突状细胞，分析单核细胞亚群及细胞因子转录本。
血浆细胞因子、趋化因子和ATP定量
验证缺血血管内IL-1β、IL-1RA、中性粒细胞趋化因子和ATP水平是否局部升高。
血浆经480 g 5分钟和2,000 g 10分钟离心后冻存；使用U-Plex Custom Biomarker Assay检测CXCL1、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-4、IL-8、IL-10、TNFα；使用LC-MS/MS靶向代谢组学检测ATP，采血后立即加入ATP清除抑制剂混合物。
单核细胞炎性小体启动与ASC斑点验证
评估缺血血单核细胞是否存在IL-1β表达增加和炎性小体启动。
100 μL全血用LPS 1.25 μg/ml和IFN-γ 100 ng/ml再刺激8小时，或用ATP 2.5 mmol/l处理30分钟；进行表面染色、红细胞裂解、0.2%皂苷透化、胞内细胞因子染色或ASC染色，流式检测；另用PBMC经ATP刺激后进行CD14/ASC免疫荧光成像。
中性粒细胞计数、NET标志物及离体NET诱导
验证缺血血管内中性粒细胞聚集、NET形成以及缺血血浆对NET形成的诱导作用。
流式检测全血中性粒细胞比例；ELISA检测血浆CitH3，胞外DNA和CitH3作为NET相关标志物；从健康供者外周静脉血分离中性粒细胞，以10%患者血浆刺激4小时，并用IL-1RA 1 ng/mL或对照底物中和IL-1β，检测CitH3及免疫荧光NET形成。
尸检脑组织NET原位验证
在人体缺血脑组织中验证NET形成及血管内定位。
获取大脑中动脉闭塞后4–5天尸检脑标本，死后8小时内收集；石蜡切片进行HE染色和免疫荧光染色，检测CitH3、MPO、NE、CD34和DAPI共定位，区分血管内和血管外NET形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞测序 | TotalSeq-C人通用混合物 | BioLegend | 399905 |
| Chromium单细胞5′试剂盒v2 | 10x Genomics | -- | |
| 血浆细胞因子检测 | U-Plex定制生物标志物检测试剂盒 | Meso Scale Discovery | K15067M-1 |
| 全血再刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L6511 |
| 干扰素-γ | PeproTech | AF-300-02 | |
| 炎性小体诱导 | 腺苷三磷酸 | Sigma-Aldrich | A6419 |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | BioLegend | 422401 |
| 细胞透化 | 皂苷 | Sigma-Aldrich | 84510 |
| 免疫荧光 | 抗CD14抗体 | Stemcell Technologies | 60004 |
| 抗ASC抗体 | Abcam | ab283684 | |
| DAPI | Carl Roth | HP20.1 | |
| NETosis诱导 | 无酚红Dulbecco改良Eagle培养基 | Thermo Fisher | 31053028 |
| 白细胞介素-1受体拮抗剂 | Thermo Fisher | 200-01RA-1MG | |
| 免疫荧光 | 多聚-L-赖氨酸包被盖玻片 | Sigma-Aldrich | P4707 |
| CitH3检测 | 瓜氨酸化组蛋白H3酶联免疫吸附试验试剂盒 | Cayman Chemical | 501620 |
| 酶标检测 | 酶标仪 | Tecan | Spark 10M |
| 免疫荧光NET染色 | 抗MPO抗体 | -- | AF3667 |
| 抗瓜氨酸化组蛋白H3抗体 | -- | ab5103 | |
| 抗ELA2抗体 | -- | MAB91671 | |
| 抗CD34抗体 | -- | M7165 | |
| AF 647驴抗小鼠 | Invitrogen | A-31571 | |
| AF 488驴抗兔 | Thermo Fisher | AF21206 | |
| AF555驴抗山羊 | Invitrogen | A21432 | |
| Vector TrueVIEW自发荧光淬灭试剂盒 | -- | SP-8400-15 | |
| HE染色 | 封片剂 | Sakura | 1408m |
| 成像 | Olympus FV3000共聚焦显微镜 | Evident | -- |
| 60× UPlanApoHR油镜 | Evident | -- | |
| HE染色成像 | NanoZoomer自动数字切片扫描仪 | Hamamatsu Photonics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集 | 缺血血采样部位为闭塞大脑中动脉血栓远端；配对非缺血动脉血来自同侧颈内动脉或主动脉；样本量n=54；部分时间缺失。 阅读提示：Methods的Study Design与Sample Acquisition Protocol，Fig 1G,H及Supplementary Methods。 |
| 多组学单细胞分析 | PBMC分离和TotalSeq-C染色、10x Genomics文库构建、NovaSeq测序、Seurat/SingleR注释流程、n=3配对样本。 阅读提示：Methods的Generation of Single-Cell RNA Sequencing Libraries、Computational Analysis，Supplementary Methods，Fig 2及Supplementary Figs S1、S2。 |
| 血浆标志物检测 | 血浆离心条件、U-Plex试剂盒和LC-MS/MS ATP检测流程、各指标样本量、非卒中对照样本来源和统计校正。 阅读提示：Methods的Plasma Preparation、Plasma Cytokine Analysis、Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics，Fig 3–5及Supplementary Tables S1、S3。 |
| 单核细胞炎性小体与ASC斑点 | 全血再刺激条件，LPS 1.25 μg/ml和IFN-γ 100 ng/ml 8小时，ATP 2.5 mmol/l 30分钟；流式抗体组合；n=17和n=23。 阅读提示：Methods的Ex Vivo Analysis of Intracellular Cytokine Production and Inflammasome Activation、ASC Speck Imaging，Fig 4，Supplementary Table S2。 |
| 离体NETosis诱导与IL-1β中和 | 健康供者中性粒细胞2×10^5/孔，10%患者血浆刺激4小时；IL-1RA 1 ng/mL或对照底物；CitH3 ELISA和免疫荧光检测；n=15和n=3。 阅读提示：Methods的In Vitro NETosis Induction、Immunofluorescence Analysis of NET Formation In Vitro，Fig 5E,F，Supplementary Methods。 |
| 尸检脑组织NET原位检测 | 尸检组织n=3，卒中后4–5天采集，死后8小时内处理；抗体稀释和成像参数；NET定位于血管内。 阅读提示：Methods的Immunofluorescence NET Staining of Postmortem Brain Tissue、Hematoxylin–Eosin Staining、Imaging，Fig 6。 |