建立MPXV Ib支鼻内感染BALB/c小鼠模型并确定致病剂量
确认Ib支在BALB/c小鼠中的感染性和致死剂量范围
以经验剂量2×10⁵ PFU鼻内感染，随后进行梯度剂量（2×10⁴、5×10⁴、1×10⁵ PFU）感染，每日监测体重和生存，计算LD50；并与IIb支（2×10⁵、5×10⁵、1×10⁶ PFU）比较
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MPXV Ib支和IIb支在BALB/c小鼠模型中的差异致病性及抗病毒治疗结局
Differential pathogenesis and antiviral treatment outcomes of MPXV clade Ib and clade IIb in a BALB/c mouse model
实验完整度
高含体外细胞系、BALB/c小鼠体内感染模型、单细胞转录组、ELISA及抗病毒药物评价，并具功能验证。
主要模型
雌性BALB/c小鼠鼻内感染模型 A549人肺上皮细胞 MRC-5人肺成纤维细胞 Vero非洲绿猴肾上皮细胞
重点核对
MPXV Ib支与IIb支鼻内接种剂量：Ib支2×10⁴、5×10⁴、1×10⁵ PFU；IIb支2×10⁵、5×10⁵、1×10⁶ PFU，每组n=6 抗病毒治疗自1 dpi开始，tecovirimat 20 mg/kg每日口服灌胃，cidofovir 10或30 mg/kg每日腹腔注射，连续6天，n=5 肺组织病毒载量：Ib支于5 dpi、IIb支于7 dpi采集；鼻甲、气管、肺于1、3、5 dpi采集，n=4 单细胞RNA测序：Ib支1×10⁵ PFU、IIb支1×10⁶ PFU感染，5 dpi采集肺组织，n=3 细胞因子ELISA：1、3、5 dpi采集肺组织，每个时间点每组3只小鼠
摘要
自2022年以来，猴痘病毒（MPXV）IIb支在全球出现，加之近期Ib支的传播，凸显了MPXV持续构成的公共卫生威胁。临床和流行病学观察提示，Ib支感染可能与IIb支感染不同，但这些差异的生物学基础仍未被充分阐明。在本研究中，我们建立了MPXV Ib支感染的鼻内BALB/c小鼠模型，并与其IIb支的致病性进行比较。Ib支在约比IIb支所需低十倍的接种剂量下即可引起致死性疾病。与IIb支相比，Ib支感染表现出更快的疾病进展、感染后期更高的肺部病毒载量以及更严重的肺部病理。单细胞转录组和细胞因子应答分析进一步揭示了在特定时间点，肺部免疫细胞格局、MPXV阳性细胞分布以及关键炎症介质表达模式存在支系特异性差异。抗病毒评估显示，tecovirimat和cidofovir对两种支系均有活性，但在Ib支感染模型中需要更高剂量的cidofovir才能实现保护。总之，这些发现建立了一个对MPXV Ib支易感的BALB/c小鼠模型，并为MPXV致病性和抗病毒治疗结局的支系依赖性差异提供了实验证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MPXV Ib支与IIb支在体内致病性和抗病毒治疗反应上是否存在差异，其生物学基础为何。
- 核心机制
- Ib支与IIb支在塑造肺部免疫应答方面存在差异，可能涉及多个基因组变异的综合效应而非单一决定因素；Ib支感染与肺部中性粒细胞及炎症性单核/巨噬细胞比例升高、特定炎症介质水平升高相关。
- 主要证据
- 鼻内BALB/c小鼠感染模型中，Ib支LD50约5.9×10⁴ PFU，IIb支约7.1×10⁵ PFU；Ib支感染后期肺部病毒载量更高、肺病理更早更重；单细胞转录组显示Ib支肺部中性粒细胞和炎症性单核/巨噬细胞比例更高、MPXV mRNA阳性细胞更多；ELISA显示Ib支TNF-α、CXCL1、CCL2在特定时间点更高；tecovirimat和cidofovir对两支均有活性，但cidofovir需更高剂量保护Ib支感染。
- 研究意义
- 为MPXV Ib支与IIb支致病性比较及在易感宿主背景下评估抗病毒干预提供了有用模型，并为MPXV致病性的支系依赖性差异提供实验证据，支持进一步研究病毒决定因素、宿主免疫应答和抗病毒疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较Ib支与IIb支的肺组织病毒载量和病理变化
评估两支在肺部的复制动态和组织损伤差异
在致死剂量感染后于1、3、5 dpi采集肺组织，用蚀斑试验检测感染性病毒、qPCR检测基因组拷贝，并进行H&E染色和IHC检测A29抗原；Ib支于5 dpi、IIb支于7 dpi另检测肺病毒滴度
评估呼吸道组织分布及上呼吸道病毒动态
确定病毒在呼吸道组织的分布及是否存在残留接种物
采集鼻甲、气管、肺及口咽拭子，qPCR检测病毒DNA，蚀斑试验检测感染性病毒；在中等剂量感染下于1、3、5、7、14 dpi检测呼吸道组织
体外肺来源细胞系中的病毒生长动力学验证
确定小鼠肺内高病毒载量是否可在体外肺来源细胞中重现
在A549和MRC-5细胞中进行一步生长（MOI=5，48 hpi）和多步生长（MOI=0.05，0、24、48 hpi）曲线分析，分别定量细胞相关病毒和细胞外病毒
单细胞转录组解析肺部免疫格局和MPXV细胞分布
比较Ib支与IIb支感染后肺部免疫细胞组成和病毒阳性细胞分布差异
在5 dpi采集肺组织制备单细胞悬液，使用GEXSCOPE™ Single-Cell RNA Library Kit建库，Illumina HiSeq X测序，Seurat v5分析，检测MPXV mRNA阳性细胞
检测肺部细胞因子和趋化因子应答
评估两支感染后肺部炎症介质表达的差异
在1、3、5 dpi采集肺组织，ELISA检测IFN-α、TNF-α、IL-10、IL-6、CXCL1、CCL2蛋白水平；qRT-PCR检测IFN-α2、IFN-β、TNF-α、IL-6、IL-10转录水平
评估tecovirimat和cidofovir的体外抗病毒活性
确定两种药物对Ib支和IIb支的体外抑制浓度
Vero细胞感染MPXV（MOI=0.1），加入系列稀释的cidofovir或tecovirimat，72 hpi收集上清qPCR定量细胞外MPXV DNA，计算IC50
体内评估tecovirimat和cidofovir对两支感染的治疗效果
比较两种药物在Ib支和IIb支致死感染模型中的保护效果
感染后1 dpi开始给药，tecovirimat 20 mg/kg每日口服灌胃，cidofovir 10或30 mg/kg每日腹腔注射，连续6天，监测体重和生存，7 dpi检测肺病毒载量和病理
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 最低必需培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| HEPES | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 动物麻醉 | 三溴乙醇 | -- | -- |
| 病毒DNA提取 | Smart 32自动化核酸提取系统 | Daan Gene | -- |
| 达安基因核酸提取试剂盒 | Daan Gene | -- | |
| qPCR | TransScript®探针一步法qRT-PCR SuperMix | TransGen Biotech | -- |
| 组织病理学 | H&E染色试剂盒 | Servicebio | -- |
| 免疫组织化学 | 兔多克隆抗痘苗病毒一抗 | Abcam | ab35219 |
| IHC试剂盒D | Servicebio | -- | |
| Western blot | 抗VACV A27抗体 | -- | -- |
| 抗β-actin抗体 | -- | -- | |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 单细胞悬液制备 | Hank平衡盐溶液 | -- | -- |
| GEXSCOPE™组织解离液 | -- | -- | |
| GEXSCOPE™红细胞裂解液 | -- | -- | |
| 单细胞RNA测序 | GEXSCOPE™单细胞RNA文库试剂盒 | -- | -- |
| Illumina HiSeq X测序平台 | Illumina | -- | |
| ELISA | IFN-α ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEA033Mu |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Lianke Biotech | EK282HS | |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEA056Mu | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEA079Mu | |
| CXCL1 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEA041Mu | |
| CCL2 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7391 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Servicebio | G2026 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Solarbio | -- |
| HiScript II一步法qRT-PCR SYBR Green试剂盒 | Vazyme | Q221-01 | |
| 病理图像采集 | 光学显微镜 | Olympus | -- |
| 病理图像分析 | Slide Viewer软件 | -- | -- |
| 免疫组化扫描 | 3DHISTECH扫描系统 | 3DHISTECH | -- |
| 免疫组化定量分析 | AIpathwell软件 | Servicebio | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism 10.4版 | GraphPad Software | -- |
| qRT-PCR数据分析 | CFX Maestro 2.3软件 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MPXV Ib支和IIb支鼻内感染BALB/c小鼠剂量-反应实验 | 小鼠品系、性别和年龄：雌性BALB/c小鼠6–8周龄；接种剂量：Ib支2×10⁴、5×10⁴、1×10⁵ PFU，IIb支2×10⁵、5×10⁵、1×10⁶ PFU；每组n=6；接种体积50 μL；麻醉剂1.25% tribromoethanol 0.2 mL/10 g；终点标准体重下降>30% 阅读提示：查阅Materials and methods中Experimental design小节及Figure 1图注 |
| 抗病毒治疗体内评价 | 感染剂量：Ib支1×10⁵ PFU，IIb支1×10⁶ PFU；治疗起始时间1 dpi；tecovirimat 20 mg/kg每日口服灌胃，cidofovir 10或30 mg/kg每日腹腔注射；给药体积200 μL；治疗持续6天；每组n=5；终点为7 dpi或体重下降>30% 阅读提示：查阅Materials and methods中Assessment of the antiviral efficacy of cidofovir and tecovirimat against MPXV小节及Figure 4图注 |
| 肺组织病毒载量和病理检测 | 感染剂量：Ib支1×10⁵ PFU，IIb支1×10⁶ PFU；检测时间点：Ib支于5 dpi、IIb支于7 dpi；样本量n=4；检测方法：蚀斑试验和qPCR；H&E染色和IHC使用Abcam ab35219 1:200 阅读提示：查阅Materials and methods中Virus titration from organs and swab samples、Quantification of viral DNA及Histopathology and Immunohistochemistry小节，Figure 1e–f、Figure 2图注 |
| 单细胞RNA测序 | 感染剂量：Ib支1×10⁵ PFU n=3，IIb支1×10⁶ PFU n=3；采样时间5 dpi；肺组织不合并；GEXSCOPE™组织解离液37°C消化15 min；测序平台Illumina HiSeq X，150 bp双端；数据分析使用Seurat v5，质控标准为少于200个基因或线粒体 reads>10%的细胞被去除 阅读提示：查阅Materials and methods中Single-cell suspension preparation、Single-cell RNA library construction and sequencing及Single-cell RNA-seq data processing and analysis小节，Figure 3图注 |
| 细胞因子和趋化因子检测 | ELISA：每组每时间点n=3，检测时间点1、3、5 dpi，检测指标IFN-α、TNF-α、IL-10、IL-6、CXCL1、CCL2；qRT-PCR：致死剂量Ib支1×10⁵ PFU、IIb支1×10⁶ PFU，非致死剂量Ib支5×10⁴ PFU、IIb支5×10⁵ PFU，每组每时间点n=3 阅读提示：查阅Materials and methods中ELISA和Cytokine profile小节及Figure 3f、Figure S8图注 |