孕早期血清蛋白质组学发现
识别与后续发生子痫前期和/或胎儿生长受限相关的孕早期母体血清蛋白质。
在POPS队列中，使用Olink Explore assay（v3.6）检测孕龄约12周母体血清中2,904种蛋白质，采用病例-队列设计比较病例与随机对照组。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Isthmin-2是子痫前期和胎儿生长受限的孕早期预测因子
Isthmin-2 is a first-trimester predictor of preeclampsia and fetal growth restriction
实验完整度
高包含三个前瞻性妊娠队列的血清蛋白质组学发现与外部验证，并在hTSCs、胎盘类器官及HEK293细胞中进行敲低和过表达功能验证，以及RNA-seq机制分析。
主要模型
妊娠结局预测研究（POPS）前瞻性队列（4,512名未产单胎孕妇） 妊娠结局预测研究2（POPS2）前瞻性队列（前2,595名有结局数据的参与者） 改善母婴妊娠与儿童结局（IMPACT）瑞典前瞻性多中心队列（432名参与者） 人滋养层干细胞（hTSC）系CT27及其分化的STB、EVT与三维胎盘类器官 HEK293细胞
重点核对
三个前瞻性妊娠队列（POPS、POPS2、IMPACT）的孕早期血清蛋白质组学检测（Olink Explore/Focus PEA面板）及其与子痫前期和/或FGR结局的关联 在hTSC中通过shRNA敲低ISM2，检测EVT分化和类器官向Matrigel侵袭能力 在HEK293细胞中过表达ISM2，通过划痕实验检测迁移能力 对ISM2敲低后的hTSC、STB、中期EVT和终末EVT进行RNA-seq与GSEA分析 ISM2敲低后加入重组ISM2蛋白对EVT形态的挽救实验
摘要
子痫前期和胎儿生长受限（FGR）是全球发病率和死亡率的主要原因。这两种疾病均与绒毛外滋养层（EVT）侵袭子宫受损相关。我们在一个前瞻性妊娠队列（妊娠结局预测研究）中，对孕龄约12周时采集的母体血清进行了蛋白质组学分析。在此我们显示，母体血清中低水平的isthmin-2（ISM2）是孕早期预测子痫前期或FGR的最强蛋白质信号（在2,904种蛋白质中）。我们在两个独立队列（妊娠结局预测研究2和改善母婴妊娠与儿童结局研究）中验证了该关联。ISM2蛋白和mRNA几乎仅在胎盘产生，并且在胎盘内，ISM2 mRNA高度富集于EVT。在培养的人滋养层干细胞中敲低ISM2可显著抑制EVT侵袭。相反，在缺乏内源性ISM2的细胞系（HEK293细胞）中表达ISM2可促进迁移。我们得出结论，ISM2可能因果性地参与滋养层侵袭失败的早期病理生理过程，并且该蛋白及其相关通路是预测和预防子痫前期和FGR的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在孕早期母体血清中，是否存在与后续发生子痫前期和/或胎儿生长受限相关的蛋白质信号，以及该蛋白质是否参与滋养层侵袭的病理生理过程。
- 核心机制
- ISM2由胎盘EVT产生，是EVT侵袭所必需；在缺乏内源性ISM2的HEK293细胞中表达ISM2足以促进迁移，提示ISM2可能因果性参与滋养层侵袭失败的早期病理生理。
- 主要证据
- 在POPS队列2,904种蛋白质中，ISM2是与四种结局均相关且排名最强的蛋白质信号；在POPS2和IMPACT队列中验证了该关联；在hTSC和胎盘类器官中敲低ISM2抑制EVT分化和Matrigel侵袭；在HEK293细胞中过表达ISM2促进迁移；RNA-seq显示敲低ISM2后EVT标志基因和整合素ITGA5、ITGA1下调。
- 研究意义
- ISM2及其相关通路是预测和预防子痫前期和FGR的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质-疾病关联的独立队列验证
在独立队列中验证ISM2与子痫前期和/或胎儿生长受限的关联。
使用POPS2队列（Olink Explore v3.10，2,859种通过质控蛋白质）和IMPACT队列（Olink Focus panel，检测ISM2和PlGF），分析ISM2与疾病结局的关联及预测性能。
ISM2在滋养层细胞和类器官中的功能验证
验证ISM2对EVT分化和侵袭能力的必要性。
在hTSC中通过shRNA敲低ISM2，诱导分化为EVT或STB，并形成三维胎盘类器官，检测EVT分化形态、Matrigel侵袭能力和标志物表达。
ISM2在HEK293细胞中的过表达功能验证
验证ISM2在缺乏内源性ISM2的细胞中是否足以促进迁移。
在HEK293细胞中通过慢病毒转导过表达ISM2，进行划痕实验和条件培养基处理实验，评估迁移能力。
ISM2敲低后的转录组分析
分析ISM2敲低对滋养层细胞转录组的影响，识别差异表达基因和富集通路。
对ISM2敲低和对照的hTSC、STB、中期EVT和终末EVT进行RNA-seq，使用DESeq2和edgeR分析差异表达基因，并进行GSEA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学检测 | Olink Explore检测 | Olink | -- |
| 蛋白质定量检测 | Olink Focus定制面板 | Olink | -- |
| 临床生物标志物检测 | Roche Eclesys检测（Cobas e411平台） | Roche Diagnostics | -- |
| 细胞培养 | TrypLE消化酶 | -- | -- |
| 类器官培养 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| 侵袭实验 | Secure-seal杂交腔垫圈 | Thermo Fisher Scientific | S24732 |
| 免疫细胞化学 | 兔抗ISM2抗体 | Proteintech | 21540-1-AP |
| 小鼠抗HLA-G抗体（克隆MEM-G/9） | Bio-Rad | MCA2044 | |
| Alexa Fluor-488抗兔IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21441 | |
| Alexa Fluor-568抗鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A11004 | |
| 含NucBlue染料的Prolong Glass抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36981 | |
| RNA提取 | RNeasy Plus小量提取试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| cDNA合成 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4368814 |
| qPCR | TaqMan多重预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4461881 |
| RNA-seq文库构建 | Illumina链特异性mRNA文库构建试剂盒 | Illumina | 20040534 |
| Illumina index试剂盒A | Illumina | 20091655 | |
| Western blot | TGX梯度胶（4%–15%） | Bio-Rad | 4561086 |
| 小鼠抗β-tubulin抗体（克隆D3U1W） | Cell Signaling Technology | 86298 | |
| 过氧化物酶标记抗鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 过氧化物酶标记抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | 细胞回收溶液 | Corning | 354253 |
| Western blot | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Fisher Scientific | 15624189 |
| 慢病毒转导 | Scr-shRNA慢病毒颗粒 | VectorBuilder | VB010000-0001mty |
| ISM2-shRNA慢病毒颗粒 | VectorBuilder | VB240726-1053qhc | |
| ISM2过表达载体 | VectorBuilder | VB900022-6681dfw | |
| 空载体对照 | VectorBuilder | VB900088-2243bzq | |
| 成像 | EVOS M5000显微镜 | Invitrogen | -- |
| iBright FL1500成像仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Nikon Eclipse Ti2荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| qPCR检测 | Olink Signature Q100微流控/qPCR仪器 | Olink | -- |
| RNA质量控制 | TapeStation RNA screen tape | Agilent Technologies | -- |
| RNA-seq | NovaSeqX测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 孕早期血清蛋白质组学发现 | 队列人群（未产单胎孕妇）、采血孕龄（约12周）、病例-队列设计、Olink Explore assay版本（v3.6）及通过质控的蛋白质数量（2,904） 阅读提示：Methods中Proteomics小节和Cohort studies小节 |
| 外部独立队列验证 | POPS2队列的样本量（前2,595名有结局数据）、Olink Explore版本（v3.10）、IMPACT队列采血孕龄（11–14周）及Olink Focus panel 阅读提示：Methods中Cohort studies小节和Proteomics小节 |
| hTSC中ISM2敲低与EVT分化/侵袭 | hTSC系CT27来源、shRNA慢病毒MOI（5）、类器官形成细胞数（5,000/40 µl Matrigel）、EVT分化培养基组成（A83-01 7.5 μM、Y-27632 2.5 µM、NRG1 100 ng ml−1等）、侵袭实验时长（12天） 阅读提示：Methods中Cell culture、ISM2 knockdown and transduction和Matrigel invasion assay小节 |
| HEK293细胞中ISM2过表达与迁移 | HEK293细胞来源、过表达载体（pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A > hISM2）、MOI（5）、划痕实验定量方法（0 h和24 h） 阅读提示：Methods中ISM2 knockdown and transduction和Wound healing (scratch) assay小节 |
| RNA-seq与差异表达分析 | 样本数（hTSC、STB、EVT mid各n=8，EVT terminal n=12）、测序平台（NovaSeqX，50-bp paired-end）、差异表达标准（adjusted p<0.05，|FC|>2）、GSEA基因集（MSigDB hallmark和C8） 阅读提示：Methods中RNA sequencing and data processing小节 |