建立人源化小鼠CRISPR基因敲除平台
验证人CD34+ HSPCs经CRISPR编辑后能否在MISTRG6小鼠体内实现高效持久基因缺失。
对TRAC和CSF1R进行CRISPR RNP编辑，电转后经肝内注射至新生MISTRG6幼鼠，流式检测基因缺失持久性及细胞发育。
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人源化小鼠中的反向遗传学揭示CARD8介导的细胞焦亡导致人DPP9缺陷中的全血细胞减少
Reverse genetics in humanized mice reveals CARD8-mediated pyroptosis causing pancytopenia in human DPP9 deficiency
实验完整度
高包含人源化小鼠体内模型、CRISPR基因编辑、体外CFU与单细胞转录组，并进行了CARD8/CASP1/NLRP1功能救援验证
主要模型
MISTRG6人源化小鼠 人CD34+ HSPCs 脐带血或胎肝来源原代人CD34+细胞
重点核对
CRISPR RNP用量：40 pmol Cas9与总计100 pmol sgRNA混合后电转 DPP9–/– HSPCs经肝内注射30,000个细胞至出生1–3天的MISTRG6幼鼠，无预处理 DPP9–/–、DPP9–/–CARD8–/–、DPP9–/–NLRP1–/–及DPP9–/–CASP1–/–分组比较骨髓与血液细胞数量 体外以Val-boropro处理CD34+ HSPCs 20小时，检测LDH释放评估焦亡 竞争性移植采用1:1对照与DPP9–/– HSPCs混合，7周后以ddPCR检测KO细胞比例
摘要
人二肽基肽酶9（DPP9）基因的功能丧失突变导致Hatipoglu综合征，引起严重的炎症小体病。该病的一个关键特征是全血细胞减少，患者需要进行骨髓移植，但细胞丢失的机制尚不清楚，因为Dpp9突变小鼠具有正常的造血功能，提示人类中可能发生不同的疾病机制。在这里，我们利用MISTRG6人源化小鼠中的反向遗传学，提出了人类DPP9缺陷的模型。我们发现，对人类CD34+造血干/祖细胞（HSPCs）进行CRISPR编辑，可在体内实现非常高效且持久的基因缺失。人类DPP9缺失再现了外周血和骨髓中的血细胞减少，且细胞丢失是细胞内在的。然而，DPP9缺失仅导致少量转录变化，提示人类HSPCs中存在转录后调控。机制上，DPP9缺陷导致CARD8炎症小体激活，引起HSPC细胞焦亡，而NLRP1对细胞死亡是非必需的。因此，我们的结果揭示了该炎症小体病的一种独特的人类疾病机制，并为其提供了治疗见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类DPP9缺陷如何在体内导致全血细胞减少，以及为何该表型在小鼠模型中不被再现。
- 核心机制
- DPP9缺陷导致CARD8炎症小体激活，引起CASP1依赖的人HSPC细胞焦亡，而NLRP1对细胞死亡非必需。
- 主要证据
- 在MISTRG6人源化小鼠中，CRISPR编辑的人DPP9–/– HSPCs在骨髓和外周血中丢失，CARD8或CASP1缺失可救援，NLRP1缺失不能救援；体外VbP处理诱导CARD8/CASP1依赖性LDH释放。
- 研究意义
- 揭示了DPP9缺陷中独特的人类疾病机制，并提示针对该炎症小体病的治疗方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DPP9缺失导致体内血细胞减少与骨髓HSPC丢失
评估人DPP9缺失在体内是否导致全血细胞减少和骨髓干细胞丢失。
设计3条靶向DPP9催化外显子的sgRNA，编辑人CD34+ HSPCs后移植MISTRG6小鼠，8–9周后检测外周血和骨髓细胞。
验证HSPC丢失的细胞内在性
确定DPP9–/– HSPC丢失是否为细胞内在缺陷。
进行体外液体培养、CFU集落形成实验、单细胞HSC扩增与分化实验，以及1:1竞争性移植结合ddPCR检测。
单细胞转录组分析DPP9缺失的转录变化
探究DPP9缺失是否通过转录重编程导致HSPC丢失。
移植后4周分选Lin–CD34+细胞，hashtag标记后10x Chromium scRNA-seq，进行差异表达与通路分析。
验证CARD8/CASP1介导的DPP9–/– HSPC焦亡
确定DPP9缺失是否通过CARD8炎症小体及CASP1导致HSPC焦亡。
体外以VbP处理编辑后CD34+ HSPCs检测LDH释放；体内进行DPP9–/–CARD8–/–、DPP9–/–NLRP1–/–、DPP9–/–CASP1–/–双敲除移植救援实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR编辑 | Cas9 | IDT | -- |
| 单链引导RNA | Synthego | -- | |
| P3缓冲液 | Lonza | V4XP-3032 | |
| Lonza 4D核转染仪 | Lonza | -- | |
| CD34+ HSPC分离 | EasySep人CD34阳性选择试剂盒II | Stemcell Technologies | -- |
| EasySep人脐带血CD34阳性选择试剂盒II | Stemcell Technologies | -- | |
| 淋巴细胞分离液 | PromoCell | -- | |
| LymphoPrep | Stemcell Technologies | -- | |
| HSPC培养 | SFEMII培养基 | Stemcell Technologies | -- |
| StemRegenin 1 | Cayman Chemical | -- | |
| UM729 | Stemcell Technologies | -- | |
| CFU实验 | MegaCult-C | Stemcell Technologies | 04974 |
| Molecular Devices Image Xpress Micro 4 (IXM)高内涵显微镜 | Molecular Devices | -- | |
| 流式分析 | BD FACSAria流式细胞分选仪 | BD | -- |
| Bigfoot光谱流式细胞分选仪 | -- | -- | |
| BD Symphony流式细胞仪 | BD | -- | |
| Cytek Aurora流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| 肝细胞分离 | II型胶原酶 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- |
| DNA酶I | Roche | 10104159001 | |
| 肺细胞分离 | D型胶原酶 | MilliporeSigma | -- |
| ddPCR | QX200微滴生成仪 | Bio-Rad | -- |
| C1000 Touch热循环仪 | Bio-Rad | -- | |
| QX200微滴读取仪 | Bio-Rad | -- | |
| DNA提取 | Quick-DNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | -- |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| 流式分析 | 可固定活性/死细胞黄色染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗人CD34抗体（克隆561） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD38抗体（HIT2） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD45抗体（HI30） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD90抗体（5E10） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD45RA抗体（HI100） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD10抗体（HI10a） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD14抗体（HCD14） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD16抗体（3G8） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD19抗体（HIB19） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD20抗体（2H7） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD33抗体（WM53） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD49f抗体（GoH3） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD56抗体（HCD56） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD66b抗体（G10F5） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD123抗体（6H6） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD68抗体（Y1/82A） | Biolegend | -- | |
| 抗人HLADR抗体（L243） | Biolegend | -- | |
| 抗小鼠CD45抗体（30-F11） | Biolegend | -- | |
| 抗人CD3抗体（OKT3） | Biolegend | -- | |
| CFU实验 | 抗人CD14抗体（M5E2） | BioLegend | 301830 |
| 抗人CD41a抗体（HIP8） | BioLegend | 303704 | |
| 抗人CD66b抗体（6/40c） | BioLegend | 392904 | |
| 抗人CD235a抗体（HI264） | BioLegend | 349114 | |
| scRNA-seq | TotalSeq抗人hashtag抗体B0251 | BioLegend | -- |
| TotalSeq抗人hashtag抗体B0252 | BioLegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR编辑与HSPC移植 | Cas9与sgRNA用量、电转程序、移植细胞数量与途径、小鼠日龄及是否预处理 阅读提示：Methods中CRISPR editing与Mice and engraftment小节；Figure 1A |
| DPP9缺失表型评估 | sgRNA序列、移植后评估时间、外周血与骨髓检测细胞亚群 阅读提示：Methods中CRISPR editing与Cell isolation for flow cytometry；Figure 2 |
| 竞争性移植与ddPCR | 对照与KO细胞混合比例、移植后时间、ddPCR探针与引物设计、分选骨髓细胞群 阅读提示：Methods中ddPCR；Figure 3G和3H |
| 体外焦亡检测 | VbP浓度、处理时长、LDH检测方法及CARD8/CASP1敲除验证 阅读提示：Methods中CFU assays and in vitro expansion assays与Results；Figure 5A |
| 救援实验 | 双基因敲除KO效率、移植后评估时间、分组与统计方法 阅读提示：Methods中CRISPR editing与Statistics；Figure 5B–5E |