ATLO及RLN B细胞亚群和BCR repertoire图谱构建
解析ATLOs中B细胞免疫应答特征，并与淋巴结对照比较
从老年WT和Apoe−/−小鼠RLN及Apoe−/−小鼠ATLOs中FACS分选CD45+白细胞，进行scRNA-seq/scBCR-seq配对，鉴定B细胞亚群、克隆扩增、SHM和CSR
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动脉三级淋巴器官编码动脉粥样硬化中的致病性高亲和力自身抗体-自身抗原对
Artery tertiary lymphoid organs encode a pathogenic high-affinity autoantibody-autoantigen pair in atherosclerosis
实验完整度
高包含scRNA-seq/scBCR-seq、抗体表达克隆与功能筛选、H2B疫苗接种及A6过继转移小鼠模型、人类队列关联分析等多层级独立证据和功能验证。
主要模型
Apoe−/−小鼠动脉粥样硬化模型 WT和Apoe−/−小鼠肾淋巴结（RLN） Apoe−/−小鼠动脉三级淋巴器官（ATLOs） AAV-PCSK9诱导的C57BL/6小鼠动脉粥样硬化模型 人类颈动脉斑块与临床队列
重点核对
ATLO GC B细胞来源的A6抗体以25−30 nM高亲和力结合重组H2B，并经Western blot、SPR和BLI验证 H2B疫苗接种（8周龄Apoe−/−小鼠，25 µg/只，12周加强，32周结束）显著增加全主动脉斑块负荷 A6抗体过继转移（100 µg/只，普通饮食每10天一次或高脂饮食每7天一次，腹腔注射）加速动脉粥样硬化 人类队列495人中循环抗H2B抗体滴度与胸主动脉钙化（TAC）正相关，校正传统风险因素后仍显著（P=0.023） 从WT RLN、Apoe−/− RLN和ATLO GC B细胞表达克隆60种抗体，筛选多反应性和斑块反应性
摘要
动脉三级淋巴器官（ATLOs）出现在动脉粥样硬化中，后者是一种具有自身免疫成分的慢性炎症性动脉疾病。然而，ATLOs中是否出现疾病相关自身免疫B细胞仍未知。在本研究中，我们从健康和动脉粥样硬化负担小鼠的ATLOs和淋巴结中分离生发中心（GC）B细胞，表达克隆60种自身抗体并筛选其动脉壁反应性。与两种基因型淋巴结中的对应抗体相比，ATLO GC B细胞来源的自身抗体偏向动脉粥样硬化相关自身抗原。一种ATLO GC B细胞来源的自身抗体（称为A6）以高亲和力结合组蛋白2B（H2B）。H2B疫苗接种和A6过继转移均加速动脉粥样硬化，揭示了一个致病性自身抗体-自身抗原对。机制上，ATLOs特异性显示扭曲的B细胞活化和免疫耐受检查点调控基因表达谱。在人类队列中，循环抗H2B抗体滴度与人类主动脉钙化正相关。我们提出，ATLOs具有失调的免疫耐受环境，允许表达致病性自身抗体、促进动脉粥样硬化的自身反应性B细胞存在。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATLOs中是否出现疾病相关自身免疫B细胞，以及能否鉴定出具有明确特异性和亲和力的致病性自身抗体-自身抗原对？
- 核心机制
- ATLOs具有失调的免疫耐受检查点环境，允许自身反应性B细胞在生发中心反应中存活并经历体细胞高频突变和亲和力成熟，产生高亲和力致病性自身抗体（如A6），该抗体与自身抗原H2B形成免疫复合物，促进动脉粥样硬化。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq/scBCR-seq配对分析ATLO GC B细胞，表达克隆60种抗体并筛选出A6；A6以高亲和力结合H2B（25−30 nM）；H2B疫苗接种和A6过继转移均加速Apoe−/−小鼠动脉粥样硬化；人类队列中抗H2B抗体滴度与TAC正相关。
- 研究意义
- 首次在任何器官或疾病的TLO中鉴定出高亲和力致病性自身抗体-自身抗原对，为动脉粥样硬化的自身免疫病因提供了证据，并提示H2B特异性治疗策略的开发基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ATLO GC B细胞自身抗体表达克隆与反应性筛选
寻找ATLO GC B细胞来源的自身反应性抗体并评估其与动脉壁和斑块的反应性
从WT RLN、Apoe−/− RLN和ATLO GC B细胞中配对IgH/IgL链，克隆至表达质粒，转染CHO或HEK293细胞表达并纯化抗体，进行免疫荧光染色检测动脉壁和斑块反应性，以及多反应性ELISA检测
A6自身抗原鉴定与结合特性验证
鉴定A6识别的自身抗原并确定其结合亲和力
使用A6抗体免疫沉淀患病小鼠主动脉裂解物，质谱鉴定候选抗原；通过Western blot、ELISA、SPR和BLI验证A6与重组H2B的结合；构建A6未突变前体抗体比较亲和力
H2B疫苗接种和A6抗体过继转移致病性验证
验证H2B自身免疫反应和A6抗体对动脉粥样硬化的致病性
8周龄Apoe−/−小鼠接受重组H2B疫苗（含佐剂）或对照，12周加强，32周评估斑块负荷；12周龄Apoe−/−小鼠接受A6抗体或对照腹腔注射，普通饮食20周或高脂饮食4周后评估斑块负荷
人类队列抗H2B抗体与主动脉钙化关联分析
检验人类循环抗H2B抗体滴度与动脉粥样硬化临床指标的相关性
在495名30-70岁接受预防性健康筛查的普通人群中进行横断面研究，检测血清抗H2B抗体滴度，胸部CT评估胸主动脉钙化（TAC），进行逻辑回归分析
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | AAV-PCSK9 | Vigene Biosciences | -- |
| 细胞培养 | Expi293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | A14527 |
| 抗体纯化 | 蛋白A琼脂糖 | Sigma-Aldrich | P3391 |
| Amicon超离心过滤器（30 kDa截留分子量） | Millipore | UFC903024 | |
| 疫苗接种 | TiterMax Gold佐剂 | Sigma-Aldrich | T2684-1ML |
| 重组H2B蛋白 | Active Motif | -- | |
| ELISA | 重组H2B蛋白 | Active Motif | 31892 |
| 高结合容量微孔板 | Costar | 9018 | |
| 人重组胰岛素 | Yeasen Biotechnology | 40112ES25 | |
| 双链DNA | Sigma-Aldrich | D4522 | |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | |
| TMB | Kementec Diagnostics | DY999 | |
| 兔抗人IgG HRP偶联抗体 | Abcam | ab6759 | |
| HRP底物 | Sigma-Aldrich | T4444 | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A | HÖLZEL Diagnostika | L00273 |
| Dynabeads蛋白G | Thermo Fisher Scientific | 10004D | |
| 单细胞BCR克隆 | RNasin Plus RNase抑制剂 | Promega | N2615 |
| 随机引物 | Invitrogen | 48190-011 | |
| SuperScript III逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| Hot Start Taq酶 | Qiagen | 203203 | |
| 单细胞测序 | SPRIselect试剂盒 | Beckman Coulter | B23317 |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 免疫荧光 | 抗小鼠CD11c抗体 | Serotec | N418 |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | 1A4 | |
| CXCR4抗体 | Abcam | UMB2 | |
| RelB抗体 | Santa Cruz Biotechnology | C-19 | |
| CD35抗体 | BD Biosciences | 8C12 | |
| BCL6抗体 | BD Biosciences | K112-91 | |
| 组织学 | Fluoromount G封片剂 | Dako | S3023 |
| 内源性生物素阻断 | 内源性生物素阻断试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | E21390 |
| 内源性H2B抗体检测 | Cy3标记链霉亲和素 | Jackson ImmunoResearch | AB_2337244 |
| 总胆固醇检测 | 胆固醇定量试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK043-1KT |
| SPR | Biacore X100 | Cytiva | -- |
| BLI | Octet R8 | Sartorius | -- |
| 蛋白A生物传感器 | Sartorius | 18-5010 | |
| 流式细胞术 | FACSAria III | BD Biosciences | -- |
| 细胞计数 | TC20自动细胞计数器 | Bio-Rad | -- |
| 测序 | NextSeq 500测序平台 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| NovaSeq X Plus测序平台 | Illumina | -- | |
| CT扫描 | 64排多探测器CT扫描仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ATLO和RLN B细胞单细胞测序 | 小鼠年龄（WT和Apoe−/−分别为8、32、78周）、组织来源（RLN和ATLO）、CD45+活细胞分选门控策略、测序平台和深度 阅读提示：Methods 'Mice'和'Single-cell isolation for single-cell profiling'及Supplementary Fig. 1 |
| ATLO GC B细胞抗体表达克隆 | GC B细胞分选门控（FVD−CD45+CD19+IgD−GL7+PNA+）、PCR引物序列、表达细胞系（CHO或HEK293）、转染和纯化方法 阅读提示：Methods 'Single GC B cell isolation for polymerase chain reaction cloning'和'Cloning of paired heavy and light chains of BCRs from single GC B cells' |
| H2B疫苗接种 | 小鼠品系和年龄（8周龄Apoe−/−雄性）、H2B剂量（25 µg/只）、佐剂（TiterMax Gold）、注射途径（腹腔）、初免和加强时间（12周）、实验终点（32周） 阅读提示：Methods 'Immunization Apoe−/− mice with H2B protein' |
| A6抗体过继转移 | 小鼠品系和年龄（12周龄Apoe−/−雄性）、抗体剂量（100 µg/只）、注射途径（腹腔或静脉）、注射频率（普通饮食每10天，高脂饮食每7天）、饮食类型和实验终点 阅读提示：Methods 'Transfer of A6 antibody in Apoe−/− mice' |
| 人类队列抗H2B抗体与TAC关联 | 队列人数（495人，418人有CT数据）、年龄范围（30-70岁）、排除标准、抗H2B抗体ELISA稀释度（1:200）、TAC定义（>100 HU，≥3个相邻像素）、统计模型协变量 阅读提示：Methods 'Clinical cohort methods'和Supplementary Table 2 |
| 抗体亲和力测定 | SPR和BLI实验条件：抗体浓度、H2B浓度梯度、流速、结合和解离时间、再生条件 阅读提示：Methods 'Determination of antibody−antigen binding affinity by SPR'和'Examination of antibody−antigen binding affinity by BLI' |