AXL表达与IAV感染相关性分析
探究IAV感染后AXL的表达动态及细胞类型分布。
分析公开RNA-seq和微阵列数据集，对IAV感染小鼠肺组织进行单细胞RNA测序，qRT-PCR检测A549细胞感染后AXL mRNA。
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AXL介导甲型流感病毒侵入并驱动病毒诱导的炎症
AXL mediates influenza A virus entry and drives virus-induced inflammation
实验完整度
高含体外细胞系、原代AM/BMDM、AXL敲除小鼠体内模型及scRNA-seq等多层证据，并有功能与机制验证。
主要模型
A549肺泡上皮细胞 HEK293T及HEK293T-SLC35A1KO细胞 小鼠原代肺泡巨噬细胞（AM）和骨髓来源巨噬细胞（BMDM） C57BL/6J及AXL敲除小鼠IAV感染模型
重点核对
A549细胞以PR8（H1N1）感染，MOI=1；R428预处理浓度3.3 μM，感染后0、2、4、8、24 hpi检测 原代AM/BMDM以PR8（MOI=1）感染，R428或AKT/ERK抑制剂预处理1 h，4°C结合后37°C内化 小鼠鼻内感染200 PFU PR8（致死模型），R428 10 mg/kg/天口服灌胃，感染当天起连续5天或感染后48 h起连续3天 H5N1假病毒侵入检测，R428、抗AXL抗体或siAXL处理，48 hpi检测荧光素酶活性 内吞途径验证：Pitstop2（20 μM）和EIPA（20 μM）预处理30 min，转铁蛋白和右旋糖酐摄取检测
摘要
甲型流感病毒（IAV）感染仍是持续存在的全球健康挑战，抗病毒药物有限。病毒侵入是抗病毒干预的潜在多面靶点；然而，有效阻止IAV侵入的获批抑制剂数量有限。在此，我们鉴定受体酪氨酸激酶AXL为IAV功能性侵入因子，在病毒入侵和宿主免疫调节中具有双重作用。尽管此前报道AXL是炎症的负调节因子，我们揭示抑制AXL同时减少病毒侵入和病毒诱导的炎症反应。机制上，AXL通过GAS6–AXL–AKT/ERK信号轴以及不同的内吞途径介导IAV入侵：在上皮细胞中为网格蛋白介导的内吞，在肺泡巨噬细胞中为巨胞饮主导的内吞。一致地，AXL敲除小鼠或感染期间早期给予AXL抑制剂可显著降低肺部病毒载量，减轻病毒诱导的细胞因子产生和肺病理损伤，并提高生存率。除IAV外，AXL还参与SARS-CoV-2、MERS-CoV和人类偏肺病毒（hMPV）的侵入，提示其作为广谱宿主导向抗病毒靶点的潜力。总之，我们的发现提供了首个体内和体外证据，表明AXL同时作为病毒侵入因子和免疫调节因子发挥双重功能，突显其作为阻断感染和控制病毒诱导炎症的治疗靶点的前景。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AXL是否作为甲型流感病毒（IAV）的功能性侵入因子，并如何影响病毒侵入及病毒诱导的炎症？
- 核心机制
- AXL通过GAS6桥接病毒表面磷脂酰丝氨酸与AXL，激活下游AKT/ERK信号，在上皮细胞中经网格蛋白介导的内吞、在肺泡巨噬细胞中经巨胞饮介导IAV侵入，并放大病毒诱导的炎症反应。
- 主要证据
- 在A549、HEK293T及原代AM/BMDM中，R428、siAXL、AXL敲除或抗AXL抗体降低病毒载量和假病毒侵入；SPR显示AXL与HA结合微弱，而GAS6结合IAV并增强侵入；AXL敲除小鼠或早期R428治疗降低肺部病毒载量、细胞因子和肺病理并提高生存率。
- 研究意义
- AXL在病毒侵入和免疫调节中发挥双重作用，且参与SARS-CoV-2、MERS-CoV和hMPV侵入，提示其作为广谱宿主导向抗病毒靶点的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AXL对IAV侵入上皮细胞的功能验证
验证AXL是否促进IAV进入上皮细胞。
R428预处理、siAXL敲低、AXL过表达、H5N1假病毒侵入、抗AXL抗体处理及SLC35A1敲除细胞中AXL过表达。
AXL对巨噬细胞感染及炎症的调控
探究AXL在AM和BMDM中对IAV感染和炎症因子释放的作用。
原代AM和BMDM感染PR8，R428处理或AXL敲除，检测病毒载量和炎症因子。
AXL下游AKT/ERK信号及内吞途径解析
明确AXL下游信号及IAV内化的内吞机制。
使用AKT抑制剂Ipatasertib、ERK抑制剂Temuterkib、JAK抑制剂Baricitinib，检测病毒载量和NP与内吞标志物共定位；转铁蛋白和右旋糖酐摄取及Pitstop2/EIPA处理。
GAS6桥接病毒与AXL的机制验证
验证GAS6是否通过结合病毒表面PtdSer桥接IAV与AXL。
SPR检测AXL与HA结合；乳胶珠偶联IAV检测Annexin V和GAS6结合；rhGAS6预处理后检测病毒结合和内化。
AXL敲除或抑制在IAV感染小鼠中的体内验证
评估AXL敲除或R428治疗对IAV感染小鼠疾病严重程度的影响。
WT和AXL-/-小鼠鼻内感染200 PFU PR8，监测体重和生存率，检测肺病毒载量、炎症因子和病理；DMSO对照和R428早期或延迟治疗组比较。
AXL作为广谱抗病毒靶点的验证
探究AXL是否参与其他呼吸道病毒侵入。
R428处理或siAXL敲低，检测SARS-CoV-2、MERS-CoV和hMPV假病毒或病毒感染；HEK293T-ACE2KO细胞中AXL过表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| AM分化 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- |
| 慢病毒包装 | pVSVG质粒 | -- | -- |
| pLP1质粒 | -- | -- | |
| pLP2质粒 | -- | -- | |
| pcDH-AXL-puro质粒 | -- | -- | |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 稳定细胞系筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 过滤 | 0.45 μm滤器 | Millipore | -- |
| 病毒纯化 | 蔗糖 | -- | -- |
| ELISA | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | -- | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | MultiSciences Biotech Co., Ltd | -- | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | MultiSciences Biotech Co., Ltd | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | MultiSciences Biotech Co., Ltd | -- | |
| Spark多功能微孔板检测仪 | Tecan | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗AXL抗体 | R&D Systems | -- | |
| 磷酸化AXL抗体 | Invitrogen | -- | |
| 甲型流感病毒H1N1血凝素（HA）抗体 | Genetex | -- | |
| 甲型流感病毒核蛋白（NP）抗体 | Genetex | -- | |
| 抗ERK抗体 | CST | -- | |
| 磷酸化ERK抗体 | CST | -- | |
| 抗AKT抗体 | CST | -- | |
| 磷酸化AKT抗体 | CST | -- | |
| Bio-Rad凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Merck Millipore | -- | |
| 病毒结合与内化 | Temuterkib | MCE | -- |
| Ipatasertib | MCE | -- | |
| R428 | MCE | -- | |
| 巴瑞替尼 | MCE | -- | |
| IgG抗体 | DIMA | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 磷脂酰丝氨酸检测 | 4-μm醛基/表面乳胶珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Annexin V结合缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 488标记Annexin V | -- | -- | |
| 人Gas6蛋白 | MCE | -- | |
| BV421偶联抗Gas6抗体 | BioLegend | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| DAPI | Sigma | -- | |
| 抗NP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101352 | |
| 抗网格蛋白抗体 | CST | 4796 | |
| 抗EEA1抗体 | CST | 3288 | |
| 抗Rab7抗体 | Abcam | ab137029 | |
| 抗AXL抗体 | R&D Systems | AF854 | |
| Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG (H+L) | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 555驴抗兔IgG (H+L) | Invitrogen | -- | |
| RNA提取与PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| QIAamp病毒RNA提取试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| HifairIII第一链cDNA合成试剂盒 | YEASEN | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA干扰 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 荧光素酶报告基因检测 | Renilla荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 转铁蛋白和右旋糖酐摄取 | Alexa Fluor-488标记转铁蛋白 | Molecular Probes | -- |
| Alexa Fluor-488标记右旋糖酐（10,000 MW） | Molecular Probes | -- | |
| SPR | Biacore 8K系统 | Cytiva | -- |
| 重组人AXL蛋白 | Acrobiosystems | AXL-H5253 | |
| 甲型H1N1流感血凝素/HA三聚体蛋白（His标签） | Sino Biological | 11684-V08H2 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 上皮细胞IAV感染与AXL抑制 | 细胞系（A549、HeLa）、病毒株（PR8 H1N1、H5N1假病毒）、MOI（1）、R428浓度（3.3 μM）、预处理时间（1 h）、检测时间点（0、2、4、8、24 hpi） 阅读提示：Methods“Virus binding and internalization assay”及Figure 1 legend |
| 原代巨噬细胞感染与AXL敲除 | AM/BMDM来源（C57BL/6J或AXL-/-小鼠）、分化时间（AM第7天，BMDM第6天）、GM-CSF浓度（20 ng/mL）、MOI（1）、检测时间点（8、12、24 hpi） 阅读提示：Methods“Cell preparations”及Figure 2 legend |
| 内吞途径验证 | 抑制剂Pitstop2（20 μM）和EIPA（20 μM）预处理30 min、转铁蛋白（25 μg/mL）和右旋糖酐（50 μg/mL）浓度、37°C孵育30 min 阅读提示：Methods“Transferrin and dextran uptake assays”及Figure 4 legend |
| 小鼠体内感染与R428治疗 | 小鼠品系（C57BL/6J、AXL-/-）、病毒剂量（200 PFU PR8）、给药途径（鼻内）、R428剂量（10 mg/kg/天）和口服灌胃方案（感染当天起5天或感染后48 h起3天）、生存率每组n=10或15 阅读提示：Methods“In vivo infections”及Figure 6 legend |
| GAS6-AXL-PtdSer桥接验证 | rhGAS6预处理浓度和时间（30 min）、IAV偶联珠与hGas6孵育60 min、未标记Annexin V浓度（20 μg/mL）、SPR HA浓度范围（0–1000 nM） 阅读提示：Methods“Detection of phosphatidylserine (PS) on the surface of IAV”和“Surface plasmon resonance (SPR)”及Figure 5 legend |