患者循环免疫细胞的转录组分析
比较长期应答者与无应答者AMIGA治疗前后PBMC的基因表达差异
对4例长期应答者和8例无应答者治疗前PBMC进行批量RNA-seq，并分析不同治疗周期样本的差异表达基因和基因集富集
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一项卵巢癌腹腔注射单核细胞联合干扰素治疗的1期试验的转录组分析揭示细胞介导免疫的支持与招募
Transcriptomic analysis of a phase 1 trial for intraperitoneal monocytes plus IFNs in ovarian cancer reveals support and recruitment of cell-mediated immunity
实验完整度
高包含患者PBMC bulk RNA-seq与scRNA-seq、患者腹水细胞因子检测及体外共培养功能验证等多层证据。
主要模型
卵巢癌患者外周血单核细胞（PBMC） 卵巢癌患者腹水样本 健康供者原代单核细胞与原代T细胞 OVCAR3、OVCAR5和OVCAR8卵巢癌细胞系
重点核对
患者样本来源：入组NCT02948426的复发、铂耐药卵巢癌患者，预处理PBMC来自4例长期应答者和8例无应答者 共培养比例与处理：OVCAR细胞与单核细胞按1:10比例共培养，加入20 ng/mL IFN-α和IFN-γ T细胞迁移检测：健康供者T细胞经anti-CD3/CD28 beads活化后置于3 µm TransWell上室，迁移24小时后用流式细胞术计数 趋化因子中和/补充实验：TCM中加入外源趋化因子或中和抗体处理6小时后引入T细胞 scRNA-seq样本：2例长期应答者的早期和晚期配对PBMC以及3例无应答者的PBMC 批量RNA-seq差异表达阈值：Benjamini-Hochberg校正后adjusted p value<0.05
摘要
背景：卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，复发阶段缺乏治疗选择。我们此前已确定腹腔注射自体单核细胞联合干扰素γ和干扰素α（AMIGA）在复发、铂耐药卵巢癌女性中的安全性和初步临床活性，但并非所有入组患者均获益，因此需要进一步分析以理解和改进该疗法。
实验设计：对接受AMIGA治疗的卵巢癌患者的循环免疫细胞进行了批量RNA测序和单细胞RNA测序。从健康供者分离原代人单核细胞和T细胞，并与卵巢癌细胞系共培养，以检测AMIGA对T细胞招募的影响。
结果：比较来自我们临床试验的长期应答者与无应答者的循环免疫细胞，发现长期应答者中细胞介导的免疫反应增加。AMIGA治疗患者的T细胞也上调了独特的、特异性T细胞受体β链基因。外周血单核细胞的批量RNA-seq显示AMIGA驱动的CXCL10和CCL2 mRNA上调。这些趋化因子的增加一致地反映在患者的恶性腹水中。最后，体外模型验证了CXCL10以及CCL2的增加，并证明这些趋化因子对T细胞趋化具有可变效应。
结论：AMIGA驱动的对T细胞招募的影响以及特定T细胞受体β链基因的上调支持未来腹腔注射AMIGA与T细胞免疫疗法联合治疗的发展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AMIGA治疗在卵巢癌患者中如何影响循环免疫细胞和腹腔肿瘤微环境，以及哪些免疫特征与临床应答相关？
- 核心机制
- AMIGA诱导CXCL10和CCL2表达，其中OC细胞是CXCL10的主要来源而单核细胞是CCL2的主要来源，CXCL10是驱动T细胞向OC细胞迁移的主要趋化因子。
- 主要证据
- 长期应答者PBMC批量RNA-seq显示T细胞活化/分化/增殖通路富集和CXCR3配体上调；scRNA-seq显示应答者T细胞贡献增加并出现独特TRBV基因；患者腹水中CXCL10和CCL2升高；三种OVCAR细胞系与单核细胞和干扰素共培养验证趋化因子产生并增加T细胞迁移，CXCL10中和显著减少迁移。
- 研究意义
- AMIGA驱动T细胞招募和特定T细胞受体β链基因上调，支持未来将腹腔注射AMIGA与T细胞免疫疗法联合的临床试验开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞水平免疫细胞亚群分析
鉴定循环单核细胞和T细胞亚群及其基因特征是否与治疗应答相关
对2例长期应答者的早期和晚期配对PBMC及3例无应答者的PBMC进行scRNA-seq，对单核细胞和T细胞进行无偏聚类和差异表达分析
患者腹水趋化因子验证
验证批量RNA-seq发现的趋化因子变化在患者腹腔局部是否一致
对3例无应答者系列腹水样本的非细胞组分进行多因子检测，测量CCL2和CXCL10等细胞因子水平
体外共培养验证趋化因子来源与T细胞迁移功能
验证AMIGA对CXCL10和CCL2产生的直接影响及其对T细胞迁移的作用
OVCAR3、OVCAR5和OVCAR8与健康供者单核细胞按1:10共培养并加入20 ng/mL IFN-α和IFN-γ，收集条件培养基检测趋化因子，并进行T细胞迁移实验和趋化因子中和/补充实验
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素和L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 单核细胞分离 | ACK裂解缓冲液 | Lonza | -- |
| 单核细胞冻存 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 细胞染色和流式细胞术 | 人TruStain FcX Fc受体封闭液 | BioLegend | -- |
| 流式细胞术 | 针对CD3、CD4、CD8a、CCR2、CXCR3、HLA-DR、CD14、CD16、EpCAM、CD45的荧光标记抗体 | BioLegend | -- |
| Ready-Flow碘化丙啶试剂 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 干扰素处理 | 干扰素α | Roferon | -- |
| 干扰素γ | R&D Systems | -- | |
| T细胞分离 | Ficoll密度梯度离心 | VWR | -- |
| T细胞分离试剂盒 | StemCell Technologies | -- | |
| T细胞活化 | 抗CD3和CD28磁珠 | -- | -- |
| T细胞迁移实验 | TransWell板 | Corning | -- |
| RT-qPCR | RNeasy Mini试剂盒和QIAshredder | Qiagen | -- |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| CCL2 TaqMan引物 | Thermo Fisher Scientific | Hs00234140_m1 | |
| CXCL10 TaqMan引物 | Thermo Fisher Scientific | Hs00171042_m1 | |
| GAPDH引物 | Life Technologies | -- | |
| TaqMan多重预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | CXCL9和CXCL11 ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| CCL2、CXCL8、IFN-α和IFN-γ ELISA试剂盒 | BioLegend | -- | |
| 多因子细胞因子检测 | 基于磁珠的多因子ELISA试剂盒 | BioLegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本分组与来源 | 长期应答者定义：接受四个或以上AMIGA治疗周期；无应答者定义：接受三个或以下周期；批量RNA-seq预处理PBMC来自4例长期应答者和8例无应答者 阅读提示：Results第一段及Methods中患者入组和样本收集描述 |
| 体外共培养与处理条件 | OVCAR:单核细胞=1:10；IFN-α和IFN-γ浓度20 ng/mL；共培养24小时后收集条件培养基；单核细胞来自健康供者 阅读提示：Methods中Co-culture and conditioned media isolation小节及Figure 4B图注 |
| T细胞迁移与趋化因子功能验证 | T细胞经anti-CD3/CD28 beads活化；TransWell孔径3 µm；迁移24小时；趋化因子中和/补充处理6小时；检测终点为流式计数 阅读提示：Methods中T cell migration assay小节及Figure 4D、4E图注 |
| scRNA-seq样本与质控 | 2例长期应答者早期和晚期配对PBMC及3例无应答者PBMC；质控去除少于200个检测基因或线粒体基因表达>25%的细胞；聚类分辨率0.2 阅读提示：Methods中Single-cell RNA sequencing小节及Figure 2、3图注 |
| 批次效应与样本量限制 | scRNA-seq样本量小，未进行统计分析；批量RNA-seq无应答者仅8例有预处理PBMC；腹水连续样本仅来自3例无应答者 阅读提示：Discussion中实验局限性描述及Results相关段落 |