临床表型评估与家系样本采集
确认先证者及家系成员临床表型并获取用于遗传分析的样本
临床遗传学家重新评估先证者及患病妹妹表型，采集外周血和皮肤活检用于DNA和RNA提取，建立成纤维细胞系
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CEP290基因新型纯合非经典剪接突变(c.1910-15_1910-11delinsTTACA)导致Joubert综合征的临床与功能特征分析
Clinical and functional characterization of a novel homozygous non-canonical splice mutation (c.1910-15_1910-11delinsTTACA) in CEP290 causing Joubert syndrome
实验完整度
中含家系样本Sanger验证、患者成纤维细胞mRNA-seq及cDNA靶向测序，但无动物模型或独立队列验证
主要模型
先证者及其患病妹妹外周血来源基因组DNA 家系成员皮肤活检成纤维细胞系
重点核对
先证者及患病妹妹为c.1910-15_1910-11delinsTTACA纯合子，父母为杂合携带者，健康妹妹不携带 患者成纤维细胞mRNA-seq和cDNA靶向测序检测到外显子20跳跃(~84%)和内含子19部分保留(~16%) 杂合父亲中异常剪接以外显子20跳跃(~25%)和内含子19保留(~4%)为主
摘要
背景：Joubert综合征(JS)是一种罕见的、主要为常染色体隐性遗传的神经发育障碍，特征为肌张力减退、运动发育迟缓、智力障碍、眼球运动失用症，以及MRI轴位图像上的标志性"磨牙征"。JS具有遗传异质性，已在40多个参与初级纤毛功能的基因中鉴定出致病性变异。其中，CEP290是最常见的突变基因之一。结果：在本研究中，我们调查了两名儿童——一名11岁男孩(先证者)和他5岁的妹妹——两人均表现出与JS一致的相似表型。父母自认为车臣人，报告有远亲血缘关系。该家庭还包括一名健康的13岁女儿。先证者此前曾由神经科医生评估并接受了全基因组测序(WGS)；然而，最初未鉴定出致病变异。在临床遗传学家重新评估表型后，我们对原始WGS数据进行了重新分析，鉴定出CEP290(NM_025114.4)中一个新型纯合内含子意义不明变异(VUS)，c.1910-15_1910-11delinsTTACA。Sanger测序证实先证者及其患病妹妹均为该变异的纯合子，该变异遗传自杂合子父母。他们健康的妹妹不携带该变异。mRNA测序和靶向cDNA测序(读取深度约100,000x)表明，该内含子变异导致CEP290前体mRNA完全异常剪接。该变异主要导致主CEP290转录本中外显子20的跳跃。此外，该变异导致内含子19部分纳入mRNA、外显子20延长58个核苷酸，以及纯合替换chr12:88114573(ACTGTGTA>TTACAGTA)。当该变异为纯合时，未检测到经典mRNA异构体。预测的严重截短和异常转录本可能通过无义介导的mRNA降解(NMD)被降解，均对应于CEP290功能的完全丧失。在将该VUS重新分类为可能致病性后，该家庭得以进行体外受精(IVF)并接受单基因病植入前遗传学检测(PGT-M)。结论：我们的研究强调了在转诊进行WES/WGS之前进行适当表型分析的关键重要性，以及将NGS与功能性mRNA研究相结合以为JS相关基因中预测剪接位点突变的患者实现分子诊断的重要性。它还强调了当基因组数据预期指导受影响家庭的生殖决策时，对VUS进行功能性重新评估的必要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CEP290基因中新型纯合非经典剪接变异c.1910-15_1910-11delinsTTACA是否导致Joubert综合征及其分子机制是什么
- 核心机制
- 该内含子变异导致CEP290前体mRNA完全异常剪接，主要表现为外显子20跳跃，其次为内含子19部分保留(58bp)伴外显子20延长，预测产生移码和提前终止密码子(p.Leu637Cysfs*12和p.Leu637Serfs*2)，异常转录本可能经NMD降解，共同导致CEP290功能丧失
- 主要证据
- 家系Sanger测序证实变异纯合状态；患者成纤维细胞mRNA-seq和靶向cDNA测序(读取深度约100,000x)显示外显子20跳跃占异常剪接读取的~84%，内含子19保留占~16%，无经典mRNA异构体检出
- 研究意义
- 强调在转诊WES/WGS前进行适当表型分析及将NGS与功能性mRNA研究结合以实现分子诊断的重要性，并说明VUS功能重分类可指导受影响家庭的生殖决策
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
WGS数据重分析与变异鉴定
在先证者中鉴定导致Joubert综合征的致病变异
对先证者原始sr-WGS数据进行重新分析，包括比对、变异检测和质量过滤，鉴定出CEP290内含子19中新型纯合变异c.1910-15_1910-11delinsTTACA
Sanger测序验证变异分离
验证候选变异在家系中的分离情况
对家系成员(V.1、V.2、V.3、IV.1、IV.2)外周血DNA进行Sanger测序，靶向内含子19
mRNA剪接功能分析
确定该内含子变异对CEP290前体mRNA剪接的影响
对先证者成纤维细胞进行mRNA测序，并对家系成员成纤维细胞cDNA进行靶向PCR和NGS分析，靶向外显子18-22区域
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | QIAamp DNA血液迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| QIAsymphony仪器 | Qiagen | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | PanEco | -- |
| 胎牛血清 | Biowest | -- | |
| RNA提取 | QIAzol裂解试剂 | Qiagen | -- |
| 全基因组文库构建 | MGIEasy无PCR DNA文库制备试剂盒 | MGI | -- |
| 全基因组测序 | DNBSEQ-T7测序仪 | MGI | -- |
| Sanger测序 | Genetic Analyzer 3500基因分析仪 | Applied Biosystems, Life Technologies | -- |
| RNA浓度测定 | Nano-500仪器 | Allsheng | -- |
| RNA完整性评估 | TapeStation系统 | Agilent | -- |
| mRNA富集 | VAHTS® mRNA捕获磁珠 | Vazyme | -- |
| RNA-seq文库构建 | VAHTS®通用V8 RNA-seq文库制备试剂盒(Illumina) | Vazyme | -- |
| mRNA测序 | SURFSeq5000测序仪 | GeneMind | -- |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA PCR | 5X ScreenMix | Evrogen | -- |
| NGS文库制备 | SG GM试剂盒 | Raissol Bio | -- |
| 靶向cDNA测序 | Illumina NextSeq平台 | Illumina, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 家系样本采集与细胞培养 | 家系成员V.1、V.2、V.3、IV.1、IV.2的身份确认；成纤维细胞培养条件(37°C、5% CO₂、DMEM+10% FBS+青霉素/链霉素+两性霉素B) 阅读提示：Methods中"Clinical data collection, blood and skin sampling, DNA and RNA extraction"小节及Fig. 1A家系图 |
| WGS数据重分析与变异鉴定 | 参考基因组版本(hg38)；变异c.1910-15_1910-11delinsTTACA的HGVS命名；LOH区域边界(chr12:80,444,130-113,101,600，32 Mb)；gnomAD v3.1.2和v4.1.0频率数据 阅读提示：Methods中"Reanalysis of WGS data and variant verification"小节及Fig. 2B-D |
| Sanger测序验证 | 引物序列(正向5'-TAGGACTCTAGTGGCAC-3'，反向5'-GGTGTCAACCCAATGGA-3')；靶向内含子19 阅读提示：Methods中"Reanalysis of WGS data and variant verification"小节及Fig. 2A |
| mRNA剪接功能分析 | RNA RIN值(7.2)；poly(A)+ RNA用量(10.4 µg)；片段化条件(85°C 6分钟)；cDNA PCR引物靶向外显子18和22；PCR产物大小(609 bp野生型、466 bp外显子20跳跃、667 bp内含子19保留)；NGS测序覆盖度(100,000×)和读长(150-bp) 阅读提示：Methods中"Total mRNA sequencing and library preparation"和"Target cDNA analysis"小节及Fig. 3A-D |