NLRP7敲除细胞系构建
建立NLRP7功能缺失模型以研究其在早期胚胎细胞中的作用。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在p-hESCs中敲除NLRP7，获得p-NLRP7−/−细胞系，并通过western blot验证。
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NLRP7通过介导可变剪接维持早期人类胚胎发育过程中的基因组稳定性
NLRP7 maintains the genomic stability during early human embryogenesis via mediating alternative splicing
实验完整度
高包含hESCs和blastoids两个独立证据层级，并进行了敲除表型、蛋白互作、RNA剪接等功能和机制验证。
主要模型
p-hESCs (primed human embryonic stem cells) n-hESCs (naïve human embryonic stem cells) human blastoids 293T cells
重点核对
NLRP7敲除p-hESCs中DNA损伤标志物γH2A.X表达升高，且中性彗星实验显示DNA碎片增加、尾长增加。 NLRP7敲除p-hESCs中凋亡标志物active caspase 3增加，但BrdU和FACS分析显示细胞增殖未受影响。 NLRP7敲除n-hESCs中γH2A.X和active caspase 3升高，且n-NLRP7−/−在P20后难以维持长期培养。 NLRP7敲除blastoids中ICM样结构变小、OCT4阳性细胞减少，同时γH2A.X和active caspase 3升高。 NLRP7敲除导致p-hESCs中RAD51和BRCA1等同源重组相关基因的可变剪接异常。
摘要
基因组不稳定性是胚胎发育异常和流产的主要原因。NLRP7功能异常会影响胚胎发育并导致葡萄胎，但其潜在机制仍 largely 不明。在这里，我们发现NLRP7敲除影响遗传稳定性，导致人类胚胎干细胞和类囊胚中DNA损伤增加，使类囊胚中的胚胎细胞更容易发生凋亡。机制上，NLRP7可与可变剪接和DNA损伤应答相关因子相互作用，包括DDX39B、PRPF8、THRAP3和PARP1。此外，NLRP7功能障碍导致人类胚胎干细胞中参与同源重组的基因发生异常可变剪接，如Brca1和Rad51。这些结果表明，NLRP7介导的可变剪接可能是早期人类胚胎发生过程中维持基因组完整性所必需的。总之，本研究揭示了NLRP7通过调控同源重组相关基因的可变剪接，在早期人类胚胎发育过程中维持遗传稳定性方面发挥重要作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- NLRP7是否以及如何维持早期人类胚胎发育过程中的基因组稳定性？
- 核心机制
- NLRP7通过介导同源重组相关基因（如RAD51和BRCA1）的可变剪接，间接影响DNA损伤修复过程。
- 主要证据
- 在p-hESCs、n-hESCs和human blastoids中，NLRP7敲除导致DNA损伤增加、凋亡增加；IP-MS和Co-IP鉴定NLRP7与DDX39B、PRPF8、THRAP3和PARP1相互作用；RNA-seq和RT-qPCR证实HR相关基因剪接异常。
- 研究意义
- 本研究揭示了NLRP7在早期人类胚胎发育中维持遗传稳定性的重要作用，并提示其功能障碍可能导致早期胚胎发育失败。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DNA损伤和凋亡表型分析
验证NLRP7敲除是否导致早期胚胎细胞DNA损伤和凋亡。
在p-hESCs和n-hESCs中，通过western blot、免疫荧光、中性彗星实验检测γH2A.X，通过免疫荧光检测active caspase 3，通过BrdU和FACS分析细胞周期。
类囊胚形成及表型分析
在更接近早期胚胎的3D模型中验证NLRP7敲除对发育的影响。
将n-hESCs在AggreWell 400中诱导形成human blastoids，通过免疫荧光分析ICM/TE标志物、γH2A.X和active caspase 3。
NLRP7互作蛋白鉴定
揭示NLRP7调控基因组稳定性的分子机制。
构建FLAG-NLRP7过表达细胞系，进行IP-MS鉴定互作蛋白，并通过Co-IP验证与DDX39B、PRPF8、THRAP3和PARP1的相互作用。
可变剪接分析
验证NLRP7是否调控同源重组相关基因的可变剪接。
对p-WT和p-NLRP7−/−进行RNA-seq，使用rMATS分析可变剪接事件，并通过RT-qPCR验证RAD51和BRCA1的剪接变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | hESC合格基质胶 | Corning | 354277 |
| mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| TrypLE Express消化液 | Gibco | 12605010 | |
| Y-27632 | SELLECK | S1049 | |
| 滋养层分化 | 骨形态发生蛋白4 | Peprotech | 120-05 |
| A83-01 | SELLECK | S7692 | |
| PD173074 | SELLECK | S1264 | |
| naïve hESCs培养 | PD0325901 | Selleck | S1036 |
| CHIR99021 | Selleck | S2924 | |
| SB590885 | Selleck | S2220 | |
| WH-4-023 | Selleck | S7565 | |
| 重组人LIF | Peprotech | 300-05 | |
| 激活素A | Peprotech | 120-14 P | |
| 成纤维细胞生长因子2 | Millipore | GF003 | |
| 类囊胚形成 | AggreWell 400 24孔板 | Stemcell | 34411 |
| 抗粘附冲洗液 | Stem Cell Technologies | 07010 | |
| RT-qPCR | RNAsimple总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | 4992858 |
| PrimeScriptRT试剂盒 | Takara | RR037A | |
| SYBR green预混液 | Takara | RR820B | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Beyotime | P1010 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | P1086 | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10015D |
| 免疫荧光 | γH2A.X抗体 | Cell Signaling Technology | 9718S |
| 活性caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661S | |
| OCT4抗体 | Santa Cruz | sc-5279 | |
| NANOG抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-097X | |
| NLRP7抗体 | Abcam | ab105405 | |
| KLF17抗体 | ATLAS ANTIBODIES | HPA024629 | |
| CDX2抗体 | Abcam | ab76541 | |
| GATA3抗体 | Abcam | ab199428 | |
| KRT7抗体 | Abcam | ab68459 | |
| HLA-G抗体 | Santa Cruz | sc-21799 | |
| BrdU抗体 | BD Biosciences | 347580 | |
| Rad51抗体 | Abcam | ab133534 | |
| Flag抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| Flag抗体 | abmart | M20008S | |
| Western blot/免疫沉淀 | GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| PRPF8抗体 | Proteintech | 11171-1-AP | |
| THRAP3抗体 | Proteintech | 19744-1-AP | |
| DDX39B抗体 | Proteintech | 14798-1-AP | |
| PARP1抗体 | Proteintech | 13371-1-AP | |
| PARP1抗体 | Proteintech | 66520-1-Ig | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 |
| 山羊抗兔IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11012 | |
| 中性彗星实验 | 低熔点琼脂糖 | Sangon Biotech | A600015-0025 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| KC-DigitalTM Stranded mRNA文库构建试剂盒 | Wuhan Seqhealth Co., Ltd. China | DR08502 | |
| QubitTM RNA宽范围检测试剂盒 | Life Technologies | Q10210 | |
| 质谱分析 | MALDI-TOF-MS仪器 | Bruker Daltonics | -- |
| 病毒浓缩 | 超滤膜 | Millipore | UFC9100 |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| 质粒构建 | pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0 | Addgene | 62988 |
| 细胞培养 | 小鼠胚胎成纤维细胞 | Millipore | PMEF-CFL |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| p-hESCs培养与分化 | Matrigel稀释比例1:30，mTeSR1培养基，5% CO2，37°C，传代比例1:8-1:10，消化时间5分钟；滋养层分化：BAP处理（10 ng/ml BMP4, 1 μM A83-01, 0.1 μM PD173074） 阅读提示：Methods中'p-hESCs culture and differentiation'小节 |
| n-hESCs培养 | 5i/L/A培养基成分（包括PD0325901, CHIR99021, SB590885, WH-4-023, Y-27632, LIF, Activin A, FGF2等），20% O2, 5% CO2, 37°C，传代比例1:6，每4-5天传代 阅读提示：Methods中'Culture of naïve hESCs (n-hESCs)'小节 |
| 类囊胚形成 | 约3×10^4 cells（~25 cells/microwell），AggreWell 400 24-well plate，5i/L/A medium，20% O2, 5% CO2, 37°C，自发腔化从day 3开始 阅读提示：Methods中'Generation of human blastoids in AggreWell'小节及Figure 3A |
| NLRP7敲除细胞系构建 | sgRNA1序列TTCTGTAGCACGTCTTCGA，sgRNA2序列TGCAGAGTCCACTCTAGCT，转染后1 μg/ml嘌呤霉素筛选3-5天，单细胞克隆挑选 阅读提示：Methods中'Plasmid construction'和'Transfection and antibiotic selection'小节 |
| RNA-seq分析 | 2 μg total RNA，KC-DigitalTM Stranded mRNA Library Prep Kit (DR08502)，DNBSEQ-T7 PE150测序，rMATS分析条件：ILD > 0.1或 < −0.1，FDR < 0.05 阅读提示：Methods中'RNA-sequencing analysis'小节及Figure 6B |