单细胞转录组分析识别细胞群
鉴定FL和tFL淋巴结中非B细胞微环境细胞群组成。
对10例患者的淋巴结活检样本进行scRNA-seq，获得非B细胞和B细胞转录组，聚类注释出13个粗分群和22个细分群。
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滤泡性淋巴瘤转化的特征：细胞因子相关的基质和巨噬细胞区室重塑
Follicular Lymphoma Transformation is Characterized by Cytokine-associated Remodeling of Stromal and Macrophage Compartments
实验完整度
高包含单细胞转录组、空间转录组、蛋白质组学及体外功能实验等多个独立证据层级，并进行了独立队列验证和功能验证。
主要模型
FL和tFL淋巴结活检样本 健康供者外周血单核细胞衍生的巨噬细胞 成纤维细胞系Hs895.T和HS-5 滤泡性淋巴瘤细胞系SC1和tFL细胞系DOHH2
重点核对
样本数量：95个FL和tFL样本用于发现队列，包括10例单细胞、19例bulk、52例空间转录组、59例CODEX样本等。 条件培养基制备：Hs895.T和HS-5细胞系培养于相应培养基（DMEM或RPMI），收集上清作为条件培养基。 巨噬细胞分化：健康供者单核细胞用40 ng/ml M-CSF分化5-6天。 SPP1处理浓度：100 ng/ml SPP1或POSTN或CCL21处理巨噬细胞48小时。 吞噬实验效应细胞与靶细胞比例：1:4，且pHrodo Red标记浓度为15 ng/ml。
摘要
在癌症中，组织学转化最常见的例子之一是滤泡性淋巴瘤（FL）向侵袭性大细胞淋巴瘤的演变。尽管最近取得了进展，但对转化的分子和细胞基础的理解仍不完整。在这里，我们通过对95个FL和转化型FL（tFL）样本的多模式研究，包括单细胞和批量RNA测序以及空间转录组学和蛋白质组学，剖析了转化过程中肿瘤和微环境细胞群的相互作用，并在独立的FL-tFL配对中验证了发现。转化后，成纤维细胞和GPNMB+巨噬细胞增加，而淋巴结组织的滤泡树突状细胞和CCL21+成纤维细胞网状细胞丢失，导致细胞因子的空间分布改变，影响T细胞浸润和巨噬细胞分化及功能。分泌的基质和巨噬细胞信号也通过非侵入性血浆蛋白质组学进一步显现。总之，我们的数据揭示了巨噬细胞和成纤维细胞的扩增是转化的关键特征，具有潜在的诊断和治疗意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 滤泡性淋巴瘤向侵袭性大细胞淋巴瘤转化过程中，肿瘤微环境中的基质和巨噬细胞区室如何变化以及相关机制。
- 核心机制
- 转化过程中，淋巴结组织性的FDCs和CCL21+ FRCs丢失，代之以CCL21-成纤维细胞和GPNMB+巨噬细胞扩增，导致趋化因子（如CCL19、CCL21、CXCL13）表达降低，进而影响T细胞浸润和巨噬细胞功能，成纤维细胞与巨噬细胞共定位并可能通过分泌信号影响巨噬细胞表型和吞噬功能，促进免疫逃逸。
- 主要证据
- 基于单细胞RNA测序、空间转录组学（GeoMx、Visium HD）、空间蛋白质组学（CODEX）、bulk RNA测序和血浆蛋白质组学，在多个独立队列中发现GPNMB+巨噬细胞和CCL21-成纤维细胞在tFL中显著增加，并在体外实验中证实成纤维细胞条件培养基可诱导巨噬细胞SPP1表达并抑制其吞噬能力。
- 研究意义
- 作者提出该发现可能为非侵入性检测转化提供潜在策略，并可能指导风险分层和治疗方法选择（如免疫治疗）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
批量转录组及去卷积验证
在独立样本集中验证单细胞发现的细胞比例变化。
对19例FFPE活检样本进行bulk RNA-seq，并用CIBERSORTx去卷积估算细胞比例。
空间转录组学定位差异细胞群
验证差异表达基因的细胞来源，并定位细胞群在组织中的位置。
对FL和tFL FFPE样本进行GeoMx空间转录组分析，用PAX5、CD3、CD68和SYTO13标记细胞类型，在B细胞、T细胞、巨噬细胞等区域提取转录组。
空间蛋白质组学验证细胞共定位
在蛋白水平验证tFL中细胞群比例变化和空间关系。
使用CODEX技术对TMA切片进行多重成像，标记13种抗体，注释细胞类型并进行空间邻近性分析。
体外功能实验验证成纤维细胞对巨噬细胞的影响
验证成纤维细胞分泌信号对巨噬细胞表型和功能的影响。
使用健康供者单核细胞衍生的巨噬细胞，暴露于成纤维细胞系条件培养基或可溶性蛋白，检测SPP1表达和吞噬能力。
血浆蛋白质组学非侵入性检测
评估转化相关可溶性信号能否在血浆中检测并区分tFL与FL。
对FL和tFL患者的血浆样本进行SomaScan靶向蛋白质组学分析，检测86种与成纤维细胞和巨噬细胞相关的蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics Chromium 系统 | 10x Genomics | -- |
| Chromium Next GEM 单细胞5'试剂盒v2 | 10x Genomics | -- | |
| RNA提取 | Qiagen Allprep FFPE 试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA测序文库构建 | TruSeq RNA Access 样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| RNA测序 | Illumina HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- |
| GeoMx空间转录组 | GeoMx空间转录组平台 | NanoString | -- |
| 人类全转录组图谱探针组 | NanoString | -- | |
| RNA玻片制备试剂盒 | NanoString | -- | |
| SYTO13核酸染料 | -- | -- | |
| 抗原修复液 | Agilent | S236784-2 | |
| 超纯水 | Invitrogen | 10977-023 | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 | |
| CODEX空间蛋白质组 | PhenoCycler Fusion平台 | Akoya Biosciences | -- |
| CODEX Keyence平台 | Akoya Biosciences | -- | |
| Visium HD空间转录组 | Visium CytAssist仪器 | 10x Genomics | -- |
| NextSeq 1000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq SP 100循环试剂盒 | Illumina | -- | |
| 伊红 | Sigma Aldrich | HT110116-500ML | |
| 血浆蛋白质组学 | SomaScan平台 | SomaLogic | -- |
| 流式细胞术 | Fortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| IMDM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 巨噬细胞分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D | 216-MC |
| 吞噬实验 | pHrodo Red染料 | Sartorius | 4649 |
| Incucyte S3活细胞成像系统 | Sartorius | -- | |
| 迁移实验 | Transwell迁移板 | Corning | 3387 |
| 分泌型磷蛋白1 | R&D | 1433-OP | |
| 骨膜蛋白 | R&D | 3548-F2 | |
| CCL21趋化因子 | R&D | 366-6C | |
| 基质细胞衍生因子1α/CXCL12 | R&D | 350-NS | |
| 单核细胞分离 | Ficoll Paque密度梯度离心液 | Global Life Sciences | 1714400 |
| EasySep人单核细胞富集试剂盒 | StemCell | 19058 | |
| Mojosort人全单核细胞分离试剂盒 | Biolegend | 480059 | |
| B细胞分离 | REAlease CD19微珠试剂盒 | Miltenyi | 130-117-034 |
| 流式细胞术 | Zombie Violet可固定活力试剂盒 | Biolegend | 423114 |
| 抗SPP1抗体 | R&D | IC14331P | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | |
| Pierce无稀释快速金BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | A55860 | |
| NuPage Bis-Tris蛋白凝胶 | Invitrogen | -- | |
| 抗SPP1抗体 | R&D | MAB1433 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| SuperSignal West Pico Plus化学发光底物 | Thermo Fisher | 34580 | |
| Amersham ImageQuant 800成像系统 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA-seq样本处理 | 样本解离方法（机械+酶解）、细胞活性、细胞负载数量（40,000个细胞/通道）、建库试剂盒版本、测序平台和参数（26bp读取1, 90bp读取2）。 阅读提示：Methods - Sample processing for single-cell analysis, RNA-sequencing |
| GeoMx空间转录组 | FFPE切片厚度、抗原修复条件（97°C 20分钟）、探针杂交时间（37°C 18小时）、抗体（PAX5, CD3, CD68）浓度、SYTO13浓度（100nM）、ROI大小（660×660 μm）。 阅读提示：Methods - GeoMx Methods, Supplementary Table 4 |
| CODEX空间蛋白质组 | 抗体克隆和浓度（见补充表11）、组织预处理（脱蜡、抗原修复）、封闭条件、抗体孵育时间（4°C过夜）、成像平台（PhenoCycler Fusion 或 Keyence）。 阅读提示：Methods - CODEX methods, Supplementary Table 11 |
| Visium HD | RNA质量（DV200 >30%）、组织切片厚度、探针杂交时间、CytAssist程序、测序参数（Read1:43nt, Read2:50nt）。 阅读提示：Methods - Visium HD methods |
| 巨噬细胞分化与处理 | 单核细胞分离方法（EasySep或Mojosort）、M-CSF浓度（40 ng/ml）、分化时间（5-6天）、条件培养基来源（Hs895.T或HS-5）、处理浓度（100 ng/ml SPP1/POSTN/CCL21）、处理时间（48小时）。 阅读提示：Methods - Isolation of monocytes and FL cells from primary blood samples, Monocyte-to-macrophage Differentiation |
| 体外功能验证 | 细胞系来源和培养条件、条件培养基制备、吞噬实验效应细胞与靶细胞比例（1:4）、pHrodo Red浓度（15 ng/ml）、实时成像时间（4小时）、分析时间点（DOHH2: 2小时, SC1:1.5小时）。 阅读提示：Methods - Cell Lines, Phagocytosis Assay |