建立标准化体外暴露平台
比较CSE和EVE对多种巨噬细胞模型炎症反应的影响
使用标准方法制备CSE（2R4F香烟）和EVE（Vaporesso XROS 3，Naked Melon），对不同来源的巨噬细胞（RAW264.7、THP-1、BMDM、PBMC）进行刺激处理。
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香烟烟雾和电子烟烟雾提取物诱导髓系生成并抑制炎症细胞因子产生
Cigarette Smoke and E-Cigarette Aerosol Extracts Induce Myelopoiesis and Suppress Inflammatory Cytokine Production
实验完整度
高包含多种体外模型（细胞系、原代巨噬细胞、PBMC）和体内小鼠吸入模型，并进行了功能（TNF-α、集落形成）和机制（ROS）验证。
主要模型
RAW264.7巨噬细胞 THP-1巨噬细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞 CD45.1/CD45.2小鼠模型
重点核对
COPD 小鼠模型 CSE浓度：0.5%-2% EVE浓度：0.5%-2% LPS浓度：10 ng/ml 暴露时间：24小时
摘要
烟草和尼古丁的使用仍然是癌症风险的主要可预防驱动因素，可燃香烟和电子尼古丁设备都会扰乱免疫功能和造血功能。然而，在造血层级中比较它们影响的并排研究仍然有限。在此，我们使用互补的体外和体内方法，评估了香烟烟雾提取物（CSE）和电子烟气溶胶提取物（EVE）对成熟髓系细胞炎症反应以及造血干细胞和前体细胞功能的影响。使用标准化方案应用于多种巨噬细胞模型，包括RAW264.7细胞、THP-1巨噬细胞、原代小鼠骨髓来源巨噬细胞和人外周血单个核细胞，我们发现CSE以剂量依赖性方式一致抑制LPS诱导的TNF-α分泌，而单独EVE作用很小。CSE还通过活性氧依赖的机制诱导巨噬细胞泡沫细胞形成。此外，CSE和EVE均抑制了造血祖细胞集落形成。为了模拟现实世界的暴露模式，我们使用口鼻吸入系统向小鼠递送可燃香烟烟雾，随后是电子烟气溶胶。顺序烟雾和电子烟暴露增加了血小板计数和髓系细胞频率，而仅戒烟未观察到这些效应。髓系偏移在二次移植后持续存在，表明对造血干细胞区室造成了持久的、细胞内在的变化。总之，这些发现表明烟草和电子烟暴露削弱了先天免疫反应，同时驱动持久的髓系偏倚造血，对感染易感性、心血管疾病和血液恶性肿瘤风险具有影响。关键词：电子烟，巨噬细胞，造血干细胞，髓系生成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 可燃香烟烟雾和电子烟气溶胶暴露如何影响成熟髓系细胞的炎症反应以及造血干祖细胞的功能？
- 核心机制
- 香烟烟雾提取物通过活性氧依赖机制抑制LPS诱导的TNF-α分泌并诱导泡沫细胞形成；香烟和电子烟暴露均抑制造血祖细胞集落形成，并导致持久的、细胞内在的髓系偏倚造血。
- 主要证据
- 多种巨噬细胞模型（RAW264.7、THP-1、BMDM、PBMC）显示CSE抑制TNF-α；CSE诱导BMDM泡沫细胞形成，NAC可部分逆转；集落形成实验显示CSE和EVE减少集落；小鼠顺序暴露后血小板和髓系细胞增加，并在二次移植后持续。
- 研究意义
- 这些发现表明烟草和电子烟暴露削弱先天免疫反应并驱动持久髓系偏倚造血，对感染易感性、心血管疾病和血液恶性肿瘤风险具有影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估CSE对巨噬细胞泡沫细胞形成的影响
检测CSE是否独立于外源性修饰脂蛋白诱导泡沫细胞形成，并测试ROS的作用
BMDMs用2% CSE或50 µg/ml OxLDL ± 5 mM NAC刺激24小时，然后Oil Red O染色，计数每细胞脂滴。
评估CSE和EVE对造血祖细胞功能的影响
检测CSE和EVE是否影响造血祖细胞的集落形成能力
小鼠全骨髓细胞与CSE或EVE孵育过夜，洗涤后接种于甲基纤维素培养基中，培养7-12天计数集落。
进行体内顺序暴露和血液学评估
模拟从可燃香烟转向电子烟使用的真实模式，观察其对造血的影响
CD45.1/CD45.2嵌合受体小鼠接受骨髓移植后，先暴露于香烟或空气2个月，然后部分切换至电子烟或空气，进行8个月鼻吸入暴露，定期采血进行血液学分析。
二次移植评估造血干细胞持久变化
验证烟雾暴露是否导致造血干细胞的持久、细胞内在改变
从一次暴露小鼠中收集骨髓，移植到经过致死辐射的受体小鼠，不进行进一步暴露，监测外周血单核细胞和中性粒细胞频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| L929细胞条件培养基 | -- | -- | |
| PBMC分离 | Lymphoprep密度梯度培养基 | Stemcell | -- |
| 烟雾提取物制备 | 2R4F研究香烟 | -- | -- |
| 电子烟暴露 | Vaporesso XROS 3电子烟 | Vaporesso | -- |
| 体内暴露 | 丙二醇 | Millipore | -- |
| 植物甘油 | Fisher Chemical | -- | |
| 1R6F认证参考香烟 | Center of Tobacco Reference Products (CTRP), University of Kentucky | -- | |
| In-Tox口鼻暴露歧管 | In-Tox Products | -- | |
| 细胞暴露 | 脂多糖 | Sigma | -- |
| 细胞处理 | N-乙酰半胱氨酸 | -- | -- |
| 氧化低密度脂蛋白 | -- | -- | |
| 泡沫细胞染色 | 油红O染色 | -- | -- |
| 集落形成实验 | 甲基纤维素培养基 | StemCell | M3224 |
| 白细胞介素-3 | -- | -- | |
| 干细胞因子 | -- | -- | |
| 细胞因子检测 | 人TNF-α ELISA试剂盒 | Invitrogen/ThermoFisher | 88-7346-88 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Invitrogen/ThermoFisher | 88-7324-88 | |
| 血小板计数 | FITC CD61抗体 | -- | -- |
| Novocyte 3000流式细胞仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 全血细胞计数 | ABCVet血液分析仪 | scilVet | -- |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD45.1抗体 | -- | -- |
| 抗小鼠CD45.2抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD11b抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD19抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠Ly6G抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD3抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD4抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD8抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠Ly6C抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD34抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD150抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD48抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠cKit抗体 | -- | -- | |
| 抗小鼠Sca-1抗体 | -- | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
| 红细胞裂解 | ACK裂解液 | -- | -- |
| 小鼠移植 | C57BL/6J小鼠 | The Jackson Laboratory | 000664 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外暴露 | CSE浓度、EVE浓度、作用时间 阅读提示：Materials and Methods，图1图例 |
| TNF-α分泌检测 | LPS浓度、暴露持续时间、检测试剂盒 阅读提示：Materials and Methods, 图1图例 |
| 泡沫细胞形成 | CSE或OxLDL浓度、NAC浓度、处理时间 阅读提示：Materials and Methods, 图3图例 |
| 集落形成实验 | 骨髓细胞来源、CSE/EVE浓度、孵育时间、集落形成条件 阅读提示：Materials and Methods, 图4图例 |
| 体内暴露模型 | 小鼠品系和来源、暴露时间表、烟雾类型、移植方案 阅读提示：Materials and Methods, 图5A |