细胞分化与3BTM生成
获取高纯度的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，并自组装形成三维脑组织模型。
使用各自优化的分化方案分别获得 iNE、iAS 和 iMG，然后按比例混合并在超低附着板中自聚集成球体。
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一种研究生理和疾病相关小胶质细胞表型的可重复人脑组织三维模型
A reproducible three-dimensional model of human brain tissue to investigate physiological and disease-associated microglia phenotypes
实验完整度
高该研究包含至少两个独立的证据层级：体外3D细胞模型（含多细胞类型），疾病模型（CRISPR敲入APP突变模拟AD）和药物处理实验，并且明确包含功能验证（电生理、钙成像）和机制验证（转录组、蛋白质组分析）。
主要模型
人诱导多能干细胞来源的三维皮质脑组织模型（3BTM） AD 3BTM 模型（APP NLGF 敲入，含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞） 人胎脑和幼年脑组织样本
重点核对
3BTM 中含 iNEs、iAS、iMGs 三种细胞，比例约为 3:1（iNEs:iAS），并添加 iMGs 使初始神经元:小胶质细胞比例为 5:1 培养维持液含 DAPT 处理 7 天，5-氟尿嘧啶和尿苷从第 3 天至第 15 天处理，之后添加 iMGs 并持续补充 IL-34、TGF-β1 和 M-CSF AD 3BTM 模型中敲入 APP NLGF 突变（瑞典、北极、伊比利亚突变），在 7889SA2 和 A18944 两种细胞系中验证 sAβ42 处理：在第8天和第10天添加 2× 500 nM 合成 Aβ42；aducanumab 处理：从第20天开始每2-3天添加 1 μg/ml scRNA-seq和蛋白质组学分析中的关键质量控制指标（如 UMIs、基因数、线粒体/核糖体读数比例）
摘要
基于干细胞的体外模型为阐明人脑细胞功能和相互作用提供了巨大潜力，但在可重复性、成熟度和细胞类型多样性方面仍存在局限。特别是成熟小胶质细胞的长期整合和神经炎症的研究一直具有挑战性。在这里，我们开发了一种基于人诱导多能干细胞的三维皮质脑组织模型（3BTM），该模型包含神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞，具有高可重复性、成熟度和活力。3BTM显示出所有细胞类型的形态学、功能学和蛋白质组学成熟，导致与体内对应细胞高度相似。整合的小胶质细胞可存活超过6个月，并表现出成熟的形态、功能和基因表达。重要的是，当被设计用于模拟阿尔茨海默病病理时，3BTM重现了关键疾病标志，包括淀粉样蛋白沉积、磷酸化tau水平升高和神经炎症，小胶质细胞将其转录谱转变为疾病相关的特征。用抗Aβ免疫疗法处理阿尔茨海默病3BTM可清除沉积物并在很大程度上逆转胶质细胞中的疾病特征。总之，我们含有小胶质细胞的模型为研究人脑组织的生理和病理状态提供了一个平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立一种可重复的人脑三维模型，使其包含神经元、星形胶质细胞和成熟的小胶质细胞，并用于研究生理状态和阿尔茨海默病（AD）相关病理及药物反应。
- 核心机制
- 3BTM 提供了一个稳定的、有丝分裂后的、具有脑样细胞外基质的微环境，促进了 iNE、iAS 和 iMG 的成熟，使小胶质细胞获得稳态表型。在 AD 模型中，APP 突变导致 Aβ 积累，进而引起 tau 磷酸化、神经炎症和小胶质细胞疾病相关转录特征。
- 主要证据
- 通过免疫染色、蛋白质组学、单细胞 RNA 测序、电生理和双光子成像证实了细胞成熟和功能；AD 模型中观察到 Aβ 沉积、p-tau 水平升高和疾病相关小胶质细胞特征；抗 Aβ 免疫治疗可清除沉积并逆转胶质细胞中的疾病特征。
- 研究意义
- 3BTM 是一种完全基于干细胞的人脑组织模型，可用于研究神经细胞和胶质细胞在生理和病理条件下的相互作用，以及 AD 等疾病的机制和药物开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模型成熟度评估
评估 3BTM 中细胞是否成熟并类似于人脑组织。
通过蛋白质组学、免疫染色、电镜、电生理和钙成像等方法分析细胞形态、突触形成、ECM 产生、星形胶质细胞成熟和小胶质细胞稳态。
小胶质细胞功能与成熟分析
验证小胶质细胞是否在3BTM中成熟并具有功能。
通过单细胞RNA测序分析小胶质细胞转录组，并通过双光子成像观察其对激光损伤的反应。
AD模型构建与验证
通过在3BTM中引入APP突变建立AD模型，并验证其是否重现AD病理。
在 iPSC 中敲入 APP NLGF 突变，分化并组装成3BTM，评估Aβ积累、tau磷酸化和神经炎症。
药物测试（Aβ免疫治疗）
测试抗Aβ免疫治疗在3BTM中的效果，验证模型能否用于药物筛选。
在3BTM中加入外源性sAβ42以诱导斑块样病理，然后使用aducanumab处理，评估Aβ清除及其对胶质细胞的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Essential 8 Flex 培养基 | Thermo Fisher Scientific | A2858501 |
| 玻璃粘连蛋白 | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
| Geltrex 基质胶 | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | |
| Matrigel 基质胶 | Corning | 356230 | |
| 小胶质细胞分化 | STEMDiff 造血试剂盒 | STEMCELL Technologies | 05310 |
| 白细胞介素-34 | Peprotech | 200-34 | |
| 转化生长因子-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-25 | |
| 细胞培养处理 | DAPT | Selleck Chemicals | S2215 |
| 5-氟尿嘧啶 | Sigma-Aldrich | F6627 | |
| 尿苷 | Sigma-Aldrich | U3750 | |
| 细胞处理 | SB431542 | Selleck Chemicals | S1067 |
| LDN-193189 | Selleck Chemicals | S2618 | |
| XAV939 | Selleck Chemicals | S1180 | |
| Y27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
| 雷公藤甲素 | Sigma-Aldrich | T3652 | |
| 茴香霉素 | Sigma-Aldrich | A9789 | |
| 哌莫硝唑盐酸盐 | Hypoxyprobe | -- | |
| AD药物处理 | 阿杜那单抗 | Denali Therapeutics | -- |
| BACE抑制剂IV | -- | -- | |
| 生化检测 | V-PLEX Plus Aβ肽检测试剂盒1 | Meso Scale Discovery | K15200G |
| 免疫印迹 | AT270抗体 | -- | -- |
| PHF1抗体 | -- | -- | |
| K9JA抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iPSC培养 | iPSC系（7889SA2, A18944, KOLF2.1J）及其来源和性别；维持在vitronectin包被的板上，使用Essential 8 Flex培养基；培养条件为37°C，5% CO2 阅读提示：Methods: Maintenance of iPSC lines |
| 3BTM生成 | iNE:iAS比例为3:1（总共250,000个细胞/孔），iMG添加量37,500个细胞/孔；培养基成分和添加剂浓度（DAPT, 5-FU, uridine）；培养板类型（超低附着96孔U型和V型板）；培养时间和培养基更换频率 阅读提示：Methods: Generation of 3BTMs |
| 小胶质细胞成熟评估 | 培养时间点（1个月和3个月）；分析指标（P2RY12表达、分支数、sensome和成体小胶质细胞特征评分）；scRNA-seq方法（10X Chromium或BD Rhapsody）和数据处理参数 阅读提示：Methods: scRNA-seq; Results: iMGs mature in 3BTMs... |
| AD模型建立 | 用于敲入的APP NLGF突变（瑞典、北极、伊比利亚），主要针对iPSC系7889SA2和A18944；验证编辑成功；用于测量Aβ分泌的免疫分析条件 阅读提示：Methods: CRISPR–Cas9 gene editing; Results: CRISPR–Cas9-mediated insertion... |
| 药物处理实验 | sAβ42处理浓度和时间（500 nM，在第8天和第10天）；aducanumab和对照抗体浓度（1 μg/ml）和处理时间表（每2-3天）；分析终点（Aβ负荷、小胶质细胞吞噬作用、CD68水平） 阅读提示：Methods: Seeding of 3BTMs with Aβ42 and treatment with aducanumab; Results: 3BTMs enable studying... |