构建REV-ERBαβ缺陷小鼠模型
研究REV-ERBαβ缺失对ILC3表型和功能的影响
通过Vav1-Cre和Ncr1Cre介导的基因敲除，获得造血细胞或NKp46+细胞特异性双敲除小鼠
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昼夜节律回路通过维持RORγt的表观遗传构型控制第3组固有淋巴样细胞的可塑性
Circadian circuits control plasticity of group 3 innate lymphoid cells by sustaining epigenetic configuration of RORγt
实验完整度
高包含基因缺陷小鼠模型、细胞移植、单细胞多组学、基因编辑功能验证及感染模型等多个独立证据层级。
主要模型
Vav1-Cre介导的造血细胞特异性REV-ERBαβ双敲除小鼠（DKO） Ncr1Cre介导的NKp46+ ILC3特异性REV-ERBαβ敲除小鼠 MNK3i细胞系 混合骨髓嵌合小鼠
重点核对
DKO小鼠在siLP中ILC1频率和绝对数增加2.5-3倍，NKp46+ ILC3减少 DKO NKp46+ ILC3中RORγt表达降低，T-bet和NFIL3表达升高 REV-ERBαβ缺陷导致Rorc基因-2kb调节元件可及性增加，NFIL3结合位点存在 SR8278处理MNK3i-Scramble细胞降低RORγt，但MNK3i-NFIL3细胞无此变化 Rorc-2kbΔ/Δ细胞中SR8278处理不再降低RORγt
摘要
肠道经历微生物组成和营养物质可利用性的日常变化，这些变化与调节生理过程（如营养摄取和免疫功能）的昼夜节律同步。依赖RORγt的第3组固有淋巴样细胞（ILC3s）通过产生IL-22来维持肠道稳态，但可以转变为产生IFNγ的、依赖TBET的ILC1s。昼夜节律蛋白对ILC3s至关重要，但其潜在机制尚不完全清楚。在这里我们显示时钟基因REV-ERBα和REV-ERBβ控制ILC3稳态。REV-ERBαβ联合缺陷使ILC3s向ILC1s转化偏移，减少ILC3能量代谢和IL-22，增强IFNγ，最终增加对啮齿柠檬酸杆菌感染的易感性。单细胞多组学和ILC3s基因编辑揭示REV-ERBαβ缺陷上调时钟蛋白NFIL3，该蛋白通过其基因中的一个调节元件抑制RORγt，从而将平衡推向TBET驱动的特性。我们得出结论，REV-ERBαβ通过调节控制RORγt表达的时钟基因来维持肠道完整性的关键ILC3功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- REV-ERBα和REV-ERBβ如何调控ILC3的稳态和可塑性？
- 核心机制
- REV-ERBαβ缺失导致NFIL3上调，NFIL3通过结合Rorc基因-2kb调节元件抑制RORγt表达，同时减弱RORγt的自身激活，使ILC3向ILC1转化。
- 主要证据
- DKO小鼠ILC1增加、ILC3减少，IL-22降低、IFNγ升高；单细胞多组学显示DKO ILC3的染色质可及性向ILC1状态转变；基因编辑实验证明NFIL3和-2kb元件的作用。
- 研究意义
- 揭示了昼夜节律回路在维持ILC3身份和功能中的关键作用，为理解肠道免疫稳态和相关疾病提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
流式细胞术分析ILC亚群
评估REV-ERBαβ缺陷对肠道和肝脏ILC亚群频率、数量和功能的影响
分离siLP、mLN和肝脏淋巴细胞，进行表面和胞内染色，分析ILC1、ILC3亚群比例、细胞因子产生和转录因子表达
C. rodentium感染模型
测试REV-ERBαβ缺陷对肠道细菌感染易感性的影响
用C. rodentium感染WT和DKO小鼠，监测体重变化和粪便细菌载量
混合骨髓嵌合实验
确定REV-ERBαβ缺陷对ILC3/ILC1比例的影响是否细胞内在性
将WT和DKO骨髓细胞1:1混合移植到致死照射的CD45.1受体小鼠，8周后分析嵌合情况
过继转移实验
体内直接验证REV-ERBαβ缺陷增强NKp46+ ILC3向ILC1转化的可塑性
从WT和DKO小鼠分选NKp46+ ILC3，过继转移到NSG受体小鼠，8周后分析供体细胞表型
单细胞多组学分析
解析REV-ERBαβ缺陷对ILC3和ILC1转录组和染色质可及性的影响
对分选的肠道ILC进行10x Multiome (scRNA-seq + scATAC-seq) 测序，分析聚类、差异基因和染色质可及性
基因编辑验证NFIL3和Rorc-2kb元件功能
验证NFIL3和Rorc-2kb调节元件在REV-ERBαβ调控RORγt中的必要性
在MNK3i细胞中使用CRISPRi和CRISPR-Cas9敲低NFIL3或删除Rorc-2kb元件，并评估REV-ERB抑制剂SR8278处理后的RORγt表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 牛血清 | HyClone | -- | |
| 细胞分离 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | -- | |
| 流式分析 | LIVE/DEAD可固定Aqua死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BD Cytofix/Cytoperm试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | -- | |
| 细胞刺激 | PMA/离子霉素 | BioLegend | -- |
| 白细胞介素-12 | -- | -- | |
| 白细胞介素-18 | -- | -- | |
| 白细胞介素-23 | -- | -- | |
| 白细胞介素-1β | -- | -- | |
| 细胞培养 | 白细胞介素-2 | -- | -- |
| 白细胞介素-7 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | 5-溴脱氧尿苷 | Sigma Aldrich | -- |
| 细胞凋亡检测 | annexin-V染色试剂盒 | MultiSciences | -- |
| 肠道通透性检测 | FITC-葡聚糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 微生物组测序 | Purelink微生物DNA纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Qubit 2.0荧光计 | Thermo Scientific | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 测序 | NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- |
| 电镜样品制备 | 1%醋酸双氧铀水溶液 | Ted Pella Inc. | -- |
| Eponate 12树脂 | Ted Pella Inc. | -- | |
| 电镜 | Leica Ultracut UCT超薄切片机 | Leica Microsystems Inc. | -- |
| JEOL 1200 EX透射电子显微镜 | JEOL USA Inc. | -- | |
| 图像分析 | ImageJ图像分析软件 | -- | -- |
| RNA-seq | RNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| SMARTer Ultra Low RNA试剂盒（用于Illumina测序） | Takara-Clontech | -- | |
| Covaris E220超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| 多组学文库制备 | Chromium Next GEM单细胞多组学ATAC+基因表达试剂盒（16次） | 10x Genomics | PN-1000283 |
| Chromium Next GEM Chip J单细胞试剂盒（48次） | 10x Genomics | PN-1000234 | |
| 单索引试剂盒N Set A（96次）（ATAC） | 10x Genomics | PN-1000212 | |
| 双索引试剂盒TT Set A（96次） | 10x Genomics | PN-1000215 | |
| KAPA文库定量试剂盒 | KAPA Biosystems/Roche | -- | |
| 基因编辑 | pLenti CMV rtTA3 Blast质粒 | Addgene | Plasmid #26429 |
| TRE3G-dCas9-KRAB-P2A-mCherry慢病毒载体 | -- | -- | |
| sgOpti载体 | Addgene | 85681 | |
| TransIT-293转染试剂 | Mirus | MIR 2700 | |
| 聚凝胺 | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| 药物处理 | SR8278 | Thermo Fisher Scientific | #554718 |
| RT-qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| iTaq通用SYBR Green超级混合物 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠基因型：Vav1-Cre Nr1d1fl/flNr1d2fl/fl (DKO) 和 Nr1d1fl/flNr1d2fl/fl (WT) 对照 阅读提示：Methods: Animals |
| 组织处理与细胞分离 | 小肠消化条件：胶原酶IV、40分钟、37°C；Percoll密度梯度离心 阅读提示：Methods: Tissue Dissociation and cell isolation |
| 流式分析 | 抗体克隆和稀释度：anti-CD45 (1:200), anti-NK1.1 (1:100)等；使用LIVE/DEAD Fixable Aqua或7-AAD排除死细胞 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis and sorting |
| 细胞刺激 | 刺激条件：PMA/ionomycin (1:500) 或 IL-23/IL-1β (10 ng/ml) 4小时；布雷菲德菌素A最后3.5小时 阅读提示：Methods: Cell stimulations and cytokine analysis |
| C. rodentium感染 | 感染剂量：1×10^10 c.f.u.；监测体重和粪便c.f.u.至20天 阅读提示：Methods: C. rodentium infection |
| 过继转移 | 分选NKp46+ ILC3（CD90+CD45loNKp46+Lin−），每只NSG小鼠注射20,000个细胞 阅读提示：Methods: Adoptive transfer |
| 基因编辑 | MNK3i细胞系；SR8278处理浓度10 μM，24小时；CRISPRi靶向Nfil3；CRISPR-Cas9删除Rorc-2kb区域 阅读提示：Methods: Editing of MNK3 cells; SR8278 treatment |