建立YAP/TAZ诱导敲低小鼠模型
模拟全身性YAP/TAZ抑制，评估其疗效和毒性
利用强力霉素诱导的shRNA小鼠模型（shYT1和shYT2）实现全身性YAP/TAZ敲低，设置shRen对照。
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YAP/TAZ-TGF-β2轴的细胞外基质重编程驱动胆管癌模型中的免疫排斥
Extracellular matrix reprogramming by the YAP/TAZ- TGF-ß2 axis drives immune exclusion in cholangiocarcinoma models
实验完整度
高包含体内shRNA小鼠模型、HDTVI诱导的CCA模型、scRNA-seq、CUT&RUN、ATAC-seq、CRISPR筛选、类器官及3C实验等多层级验证。
主要模型
小鼠胆管癌（CCA）模型（HDTVI诱导的NICD/myr-AKT模型） 小鼠CCA类器官 小鼠（全身性、CAF特异性、肿瘤细胞特异性YAP/TAZ敲低） 患者CCA样本（TCGA数据）
重点核对
YAP/TAZ敲低效率：约80%-90%蛋白水平降低 YAP/TAZ耗竭方式：持续 vs 间歇多西环素给药 剂量与时间：VT104（10 mg/kg或1 mg/kg），抗PD-1（10 mg/kg），CD8耗竭（500 μg抗CD8） 肿瘤模型：HDTVI注射pSBbi-Myr-AKT-HA、pSBbi-Myc-NICD、pCMV-SB100质粒 关键靶基因：Tgfb2敲除或过表达对肿瘤生长的影响
摘要
Yes相关蛋白（YAP）和含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）是Hippo通路的关键效应因子，在癌症中常过度激活，促进肿瘤进展和治疗耐药。其致癌作用依赖于与TEA结构域（TEAD）转录因子的相互作用，使TEAD-YAP/TAZ复合物成为有前景的治疗靶点。利用转化小鼠模型，我们发现持续的全身性YAP和TAZ（YAP/TAZ）耗竭会引起严重副作用。通过脉冲式抑制可避免这些副作用，并能有效抑制肿瘤生长，即使在晚期也是如此。我们确定Tgfb2是YAP/TAZ驱动肿瘤形成的关键靶基因，并证明YAP/TAZ通过激活组织重塑基因驱动T细胞排斥。因此，YAP/TAZ抑制增强了免疫细胞浸润。然而，浸润的T细胞迅速发生耗竭。将YAP/TAZ抑制与免疫检查点阻断相结合可逆转这种耗竭，并使耐药肿瘤对免疫治疗敏感。这种联合疗法重塑了肿瘤微环境以支持免疫细胞浸润和活化，代表了一种在最大程度增强抗肿瘤免疫的同时最小化毒性的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YAP/TAZ抑制在胆管癌中的治疗潜力如何，其机制是否涉及细胞外基质重塑和免疫微环境调节？
- 核心机制
- YAP/TAZ通过远端增强子驱动Tgfb2表达，TGF-β2介导细胞外基质重塑和T细胞排斥。YAP/TAZ抑制可促进T细胞浸润但导致耗竭，联合免疫检查点阻断可逆转耗竭。
- 主要证据
- 体内shRNA模型显示YAP/TAZ敲低抑制肿瘤生长并延长生存，scRNA-seq显示免疫浸润增加，CUT&RUN和3C证实Tgfb2为直接靶基因，Tgfb2回补实验恢复肿瘤生长。
- 研究意义
- 为YAP/TAZ抑制剂与免疫检查点抑制剂联合治疗胆管癌提供概念验证，可能将免疫治疗耐药肿瘤转化为敏感肿瘤。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估YAP/TAZ耗竭对CCA肿瘤生长的影响
检测YAP/TAZ抑制对肿瘤生长的治疗作用
采用HDTVI诱导的N-AKT CCA模型，在预防或治疗模式下进行YAP/TAZ耗竭，监测生存和肿瘤负担。
确定YAP/TAZ耗竭对肿瘤微环境的影响
研究YAP/TAZ抑制对免疫细胞浸润和激活的影响
通过scRNA-seq分析急性YAP/TAZ耗竭后的肿瘤免疫微环境，重点评估T细胞和NK细胞的浸润、激活状态及细胞间通讯。
验证CD8+ T细胞在YAP/TAZ耗竭疗效中的作用
确定CD8+ T细胞是否为YAP/TAZ耗竭生存获益所必需
在YAP/TAZ耗竭期间通过抗CD8抗体清除CD8+ T细胞，比较生存差异。
评估YAP/TAZ耗竭与免疫检查点阻断的协同作用
测试抗PD-1治疗能否增强YAP/TAZ耗竭的抗肿瘤效果
在shRen和shYT2小鼠中给予抗PD-1抗体，分析生存和肿瘤负担；同时用TEAD抑制剂VT104验证。
鉴定YAP/TAZ的直接靶基因
寻找YAP/TAZ调控的、驱动肿瘤生长和免疫排斥的关键下游基因
结合CUT&RUN（TEAD1、YAP）、ATAC-seq、RNA-seq和scRNA-seq数据，鉴定直接靶基因；进行体内CRISPR筛选敲除候选基因，验证Tgfb2功能；通过3C和报告基因实验验证增强子机制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因敲低模型建立 | TRE-tGFP-shYAP1.351（shY1） | Mirimus | -- |
| TRE-tGFP-shYAP1.322（shY2） | Mirimus | -- | |
| TRE-tGFP-shWwtr1.2056（shT1） | Mirimus | -- | |
| TRE-tGFP-shWwtr1.4587（shT2） | Mirimus | -- | |
| TRE-tGFP-shRen | Mirimus | -- | |
| 基因表达调控 | 多西环素盐酸盐 | Sniff | 326652 |
| 质粒构建 | pCMV(CAT)T7-SB100 | Addgene | 34879 |
| pT3-myr-AKT-HA | Addgene | 31789 | |
| pT3-EF1aH NICD | Addgene | 86500 | |
| pSBbi-Pur | Addgene | 60523 | |
| PX552 | Addgene | 60958 | |
| pGL4-23 | Promega | 9PIE841 | |
| 动物模型 | iCas9 | The Jackson Laboratory | 029476 |
| 免疫治疗 | 抗PD-1抗体（克隆RMP1-14） | Bio X Cell | BE0146 |
| 免疫细胞清除 | 抗CD8抗体（克隆YTS169） | -- | -- |
| TEAD抑制 | VT104 | Vivace Therapeutics | -- |
| 免疫组化 | YAP1抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 |
| Sox9抗体 | MilliporeSigma | 5535 | |
| CK19抗体（TROMA-III） | DSHB | -- | |
| CD3抗体 | Abcam | ab16669 | |
| CD8抗体 | Cell Signaling Technology | 98941S | |
| DAB显色剂 | Vector Laboratories | -- | |
| 增殖检测 | Click-iT EdU细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 组织染色 | 天狼星红 | -- | -- |
| 显微镜成像 | Axio Scan.Z1显微镜 | Zeiss | -- |
| Panoramic II扫描仪 | 3DHISTECH | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| NEBNext Poly(A) mRNA磁分离模块 | New England Biolabs | -- | |
| NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E6440 | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina NextSeq 500 | Illumina | -- | |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒3.1版 | 10x Genomics | -- |
| Singleron GEXSCOPE单细胞RNA文库试剂盒V2 | Singleron | -- | |
| TotalSeq-B hashtag抗体 | BioLegend | -- | |
| Fc受体封闭试剂 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CUT&RUN | TEAD1抗体 | Cell Signaling Technology | 12292 |
| H3K27Ac抗体 | Abcam | ab4729 | |
| H3K4me1抗体 | Cell Signaling Technology | 5326 | |
| 伴刀豆球蛋白A包被磁珠 | Polysciences | -- | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7645 | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Illumina | -- |
| Zymo DNA清洁与浓缩试剂盒-5 | Zymo Research | -- | |
| 3C | DpnII | -- | -- |
| T4 DNA连接酶 | -- | -- | |
| Phusion Hot Start II DNA聚合酶 | -- | -- | |
| 基因表达分析 | TRIzol | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 诱导敲低模型 | shRNA小鼠品系（shYT1、shYT2）、多西环素给药方式（持续或间歇、剂量625 mg/kg饮食）、敲低效率（80%-90%蛋白降低） 阅读提示：Methods: Mouse strains, Doxycycline administration; Figure 1 |
| CCA肿瘤模型建立 | HDTVI注射质粒量（25 μg pSBbi-Myr-AKT-HA、25 μg pSBbi-Myc-NICD、10 μg pCMV-SB100）、注射体积（10%体重）、注射时间（6-8秒） 阅读提示：Methods: Hydrodynamic tail vein injection; Figure 2 |
| YAP/TAZ急性耗竭 | 耗竭开始时间（第25天）、分析时间（第33天）、多西环素给药时长 阅读提示：Methods: Doxycycline administration; Figure 3 |
| CD8+ T细胞清除 | 抗CD8抗体剂量（500 μg i.p.）、给药时间点、清除效果验证（流式） 阅读提示：Methods: Anti-CD8 and anti-PD-1 administration; Figure 5 |
| 免疫检查点阻断 | 抗PD-1抗体剂量（10 mg/kg i.p.）、给药时间点 阅读提示：Methods: Anti-CD8 and anti-PD-1 administration; Figure 6 |
| TEAD抑制剂处理 | VT104剂量（10 mg/kg或1 mg/kg）、给药方式（口服灌胃）、制剂制备（5% DMSO, 10% Solutol, 85% D5W） 阅读提示：Methods: VT104 administration; Figure 6 |
| 类器官培养 | 类器官来源（CCA肿瘤）、VT104处理浓度和时间（24小时） 阅读提示：Methods: 见于Supplemental Methods; Figure 9 |
| scRNA-seq | 平台（10x Genomics或Singleron）、细胞数量、测序深度（50,000或25,000 reads/细胞）、分析软件版本 阅读提示：Methods: scRNA-seq analysis; 图例中样本数 |