鉴定Bcat1作为分化相关代谢基因
寻找在肌成纤维细胞分化中差异表达的代谢基因，并筛选在纤维化心脏中表达上调的候选分子。
利用已发表的微阵列数据（GSE158236和GSE158157），比较粘附、非粘附和重粘附肌成纤维细胞中代谢过程相关基因的表达，筛选出在去分化中下调、再分化中上调且在MI心脏中高表达的基因，并通过qRT-PCR验证Bcat1的表达变化。
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支链氨基酸转氨酶1介导的通路促进心肌成纤维细胞中脯氨酸依赖的胶原蛋白产生
Branched chain amino acid transaminase 1-mediated pathway promotes proline-dependent collagen production in cardiac myofibroblasts
实验完整度
高包含体外细胞模型（原代成纤维细胞、细胞系）、动物MI模型、Bcat1-KO小鼠、scRNA-seq和蛋白质组学等多证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠心肌梗死后心脏原肌成纤维细胞样成纤维细胞和肌成纤维细胞 小鼠心脏常驻成纤维细胞 小鼠MASH肝纤维化模型 人类心力衰竭心脏样本 人类MASH肝脏样本
重点核对
小鼠心肌梗死模型：8-10周龄雄性C57BL/6N小鼠，结扎左冠状动脉前降支 Bcat1-KO小鼠模型：CRISPR/Cas9介导，靶向Bcat1外显子2 siRNA敲低Bcat1后检测ALDH18A1、PYCR1、EPRS表达及SMAD3/HDAC5磷酸化 ERG240（BCAT1抑制剂）处理：2 mM体外，250或500 mg/kg体内 BCAA补充恢复siBcat1介导的效应
摘要
肌成纤维细胞是负责胶原蛋白产生、导致组织纤维化的细胞。由于胶原蛋白总氨基酸中20.5%为脯氨酸，肌成纤维细胞在分化过程中必须获得发育良好的脯氨酸产生机制。然而，肌成纤维细胞获得并维持这种发达的脯氨酸生物合成机制的详细机制仍不清楚。在这里，我们展示支链氨基酸（BCAA）转氨酶1（Bcat1）在表达Periostin（Postn）的原肌成纤维细胞样成纤维细胞（这些是向完全分化的肌成纤维细胞过渡的细胞）以及小鼠和人类纤维化心脏和肝脏中的肌成纤维细胞的一个相当大的亚群中上调，并促进脯氨酸的产生。BCAT1产生的BCAA通过HDAC5在Ser488位点的磷酸化促进SMAD3磷酸化，从而增强原肌成纤维细胞样成纤维细胞和肌成纤维细胞中脯氨酸生物合成相关基因Aldh18a1、Pycr1和Eprs的SMAD3依赖性转录。在BCAT1缺陷小鼠中，心肌梗死后其心脏中脯氨酸生物合成相关基因的表达显著减弱，导致心脏纤维化减少。此外，用BCAT1抑制剂治疗的心肌梗死小鼠心脏纤维化减少。我们的结果确定了BCAT1介导的通路，通过在原肌成纤维细胞样成纤维细胞和肌成纤维细胞中调节脯氨酸生物合成来促进胶原蛋白产生，这可能为心脏纤维化提供治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肌成纤维细胞如何获得并维持发达的脯氨酸生物合成机制以支持胶原蛋白的大量产生？
- 核心机制
- BCAT1通过产生支链氨基酸（BCAA），促进HDAC5 Ser488磷酸化，进而促进SMAD3磷酸化，增强SMAD3依赖性转录，上调脯氨酸合成酶ALDH18A1和PYCR1以及脯氨酰-tRNA合成酶EPRS的表达，从而增加脯氨酸合成，支持胶原蛋白蛋白产生。
- 主要证据
- 通过体外机械刺激和TGF-β刺激模型、MI小鼠模型、Bcat1-KO小鼠、scRNA-seq、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学等，证实BCAT1表达上调，并调控上述信号通路和下游基因表达，影响胶原蛋白产生和心脏纤维化。
- 研究意义
- 本研究揭示了BCAT1介导的促进胶原蛋白产生的通路，为心脏纤维化提供了潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证机械刺激和TGF-β信号诱导Bcat1表达
确定Bcat1表达是否受机械刺激和TGF-β信号调控。
将非粘附肌成纤维细胞重新接种至塑料培养板以施加机械刺激，检测Bcat1 mRNA表达随时间的变化；在不同刚度（0.4、6.4、25.6 kPa）的聚丙烯酰胺凝胶上培养NIH3T3细胞，检测Bcat1表达；使用细胞松弛素抑制剂latrunculin A和整合素抑制剂BTT-3033处理肌成纤维细胞，检测Bcat1表达；用TGF-β刺激心脏常驻成纤维细胞，检测Bcat1表达。
在MI心脏和纤维化肝脏中确定Bcat1表达细胞
鉴定Bcat1在纤维化组织中表达的细胞类型，尤其是在肌成纤维细胞分化过程中的表达时相。
利用scRNA-seq数据（E-MTAB-7376）分析心肌梗死后心脏基质细胞中Bcat1的表达；通过原位杂交（ISH）和免疫组化（IHC）共染色确定Bcat1 mRNA与COL1A1、αSMA、Postn和Snai1的共定位；同时检测肝脏MASH模型和人类样本中Bcat1的表达。
验证Bcat1调控脯氨酸合成相关基因表达
探索Bcat1对脯氨酸合成酶（Aldh18a1、Pycr1）和脯氨酰-tRNA合成酶（Eprs）表达的影响。
在原肌成纤维细胞样成纤维细胞中敲低Bcat1（siBcat1），通过RNA-seq分析差异表达基因，结合scRNA-seq数据（Bcat1+ vs Bcat1-），筛选出Aldh18a1、Pycr1、Eprs；通过qRT-PCR和Western blot验证敲低Bcat1后这些基因的表达变化；并测量细胞内脯氨酸水平。
探究BCAT1促进胶原蛋白产生的机制
阐明BCAT1调控SMAD3磷酸化并促进脯氨酸合成及胶原蛋白表达的具体信号通路。
通过Western blot检测siBcat1对SMAD3磷酸化的影响；通过ChIP-qPCR检测SMAD3在Aldh18a1、Pycr1、Eprs启动子上的结合；通过磷酸化蛋白质组学鉴定HDAC5 Ser488磷酸化；通过BCAA补充和HDAC5突变体实验验证信号通路。
体内评估Bcat1缺失对心肌纤维化的影响
在体内验证Bcat1缺失对心肌梗死后纤维化和心脏功能的影响。
使用Bcat1-KO小鼠和野生型对照，建立MI模型；通过qRT-PCR、Western blot检测胶原蛋白和脯氨酸合成相关基因表达；通过天狼星红染色评估心肌纤维化程度；通过超声心动图评估心脏功能。
验证BCAT1抑制剂ERG240的治疗效果
评估BCAT1抑制剂ERG240对心肌梗死后纤维化和心脏功能障碍的治疗潜力。
在体外，用ERG240处理原肌成纤维细胞样成纤维细胞，检测相关基因和蛋白表达；在体内，对MI小鼠给予ERG240（250或500 mg/kg，腹腔注射），通过天狼星红染色和超声心动图评估纤维化和心脏功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Nacalai Tesque | -- |
| 胎牛血清 | Gibco, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MEM培养基 | Nacalai Tesque | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Nacalai Tesque | -- | |
| Accutase | Nacalai Tesque | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA溶液 | -- | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PEI-Max转染试剂 | Polysciences | -- | |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | -- | |
| 细胞分离 | II型胶原酶 | Worthington Biochemical | -- |
| 弹性蛋白酶 | Worthington Biochemical | -- | |
| 碎片去除溶液 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Roche | -- | |
| CD45抗体偶联磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Nacalai Tesque | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Nacalai Tesque | -- | |
| RNA提取 | RLT Plus缓冲液 | QIAGEN | -- |
| QIAshredder柱 | QIAGEN | -- | |
| ISOGEN试剂 | Nippon Gene | -- | |
| RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| RT-qPCR | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific | -- |
| Luna Universal qPCR预混液 | New England BioLabs | -- | |
| 细胞处理 | 拉特伦库林A | Abcam | -- |
| BTT-3033 | Tocris Bioscience | -- | |
| ERG240 | -- | -- | |
| 重组TGF-β | R&D Systems | -- | |
| 重组TNF-α | Peprotech | -- | |
| 脂多糖 | MilliporeSigma | -- | |
| 代谢物检测 | 4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑 | -- | -- |
| Singularity RP18色谱柱 | Singularity | -- | |
| Singularity MX-103色谱柱 | Singularity | -- | |
| Singularity CSP-001S色谱柱 | Singularity | -- | |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| 抗SMAD2/3抗体 | -- | -- | |
| 蛋白质组学 | 胰蛋白酶/Lys-C混合酶 | Promega | -- |
| Pierce定量比色肽测定试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TMTpro 16-plex标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Vanquish DUO超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-nLC 1200超高效液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18反相色谱柱 | Nikkyo Technos | -- | |
| Proteome Discoverer软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 组织染色 | 天狼星红缓冲液 | -- | -- |
| 直接红 | -- | -- | |
| RNAScope多重荧光v2检测 | Advanced Cell Diagnostics | -- | |
| 酪酰胺-Cy3 | PerkinElmer | -- | |
| 酪酰胺-Cy5 | PerkinElmer | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6N小鼠 | Japan SLC | -- |
| CDAHFD饲料（A06071302N） | Research Diets | A06071302N | |
| 标准饲料（A06071314N） | Research Diets | A06071314N | |
| ERG240 | -- | -- | |
| 数据采集 | StepOnePlus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 共聚焦显微镜（LSM700或LSM980） | Carl Zeiss | -- | |
| 显微镜（BZ-X700） | Keyence | -- | |
| Nemio XG图像分析系统（SSA-580A） | Toshiba Medical Systems | SSA-580A | |
| Image Lab软件 | Bio-Rad | -- | |
| GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | 9.3.1 | |
| 细胞培养耗材 | 超低附着表面细胞培养板 | Sumitomo Bakelite | -- |
| 聚丙烯酰胺凝胶制备 | 32毫米微型盖玻片 | Matsunami | -- |
| 3-氨基丙基三甲氧基硅烷 | MilliporeSigma | -- | |
| Pierce Sulfo-SANPAH，无称量形式 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 纤连蛋白 | MilliporeSigma | -- | |
| 细胞培养 | 无谷氨酰胺DMEM（GMEP） | -- | -- |
| 动物实验 | NEPA21电穿孔仪 | Nepagene | -- |
| i-GONAD | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞处理 | TGF-β、TNF-α、LPS刺激浓度和时间 阅读提示：Methods: Stimulation of cells with various reagents |
| 细胞处理 | Latrunculin A、BTT-3033、ERG240处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Stimulation of cells with various reagents |
| 细胞培养 | 细胞培养基、血清浓度、添加物（如丙酮酸钠） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 基因敲低/过表达 | siRNA序列、转染试剂、转染时间 阅读提示：Methods: Knockdown using siRNA; Retrovirus transduction |
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、年龄、手术方式、MI术后时间点 阅读提示：Methods: Surgical procedure; Results: MI induces Bcat1 expression... |
| 蛋白检测 | 裂解缓冲液成分、抗体信息、封闭条件 阅读提示：Methods: Western blotting; 补充表6 |
| 代谢物检测 | 3D-HPLC条件、样品制备、衍生化试剂 阅读提示：Methods: Determination of l-proline and BCAAs using 3D-HPLC |
| 蛋白质组学 | 质谱参数、データ处理流程（如FDR、归一化） 阅读提示：Methods: TMT-based proteomics analysis |