DNA甲基化组分析
比较PAD（IC和CLI）与CON骨骼肌的DNA甲基化差异
使用RRBS对骨骼肌样本进行DNA甲基化测序，比较IC vs CON、CLI vs CON、IC vs CLI的差异甲基化位点，并进行通路富集分析。
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骨骼肌多组学分析识别外周动脉疾病中缺氧诱导基因的失调
Multiomics Analysis of Skeletal Muscle Identifies Dysregulation of Hypoxia-Induced Genes in Peripheral Artery Disease
实验完整度
中研究包含横断面队列（CON、IC、CLI）和配对干预（血运重建前后）的组学分析（RRBS、RNA-seq、small RNA-seq），并进行独立队列验证，但缺乏功能性验证实验，如甲基化编辑或动物模型。
主要模型
非PAD对照组骨骼肌活检样本 间歇性跛行患者骨骼肌活检样本 严重肢体缺血患者骨骼肌活检样本
重点核对
样本量：每组10例（CON、IC、CLI） 性别比例：IC组90%男性，CON组40%男性，CLI组50%男性 DMR定义：FDR≤0.05且甲基化差异绝对值≥0.2 DEG定义：FDR≤0.05（IC vs CON使用名义P值<0.05进行探索性分析） 血运重建前后配对分析：IC患者基线及6个月后
摘要
背景：表观遗传修饰如DNA甲基化在缺氧细胞程序中发挥关键作用。然而，尚无研究探讨外周动脉疾病（PAD）中基因表达的表观遗传调控，PAD是一种以间歇性缺血为特征的疾病。本研究旨在探讨PAD如何影响间歇性跛行或严重肢体缺血患者骨骼肌的DNA甲基化组，并与非PAD对照组进行比较。方法：这是一项横断面研究，使用简化代表性亚硫酸盐测序以及小RNA和总RNA测序评估非PAD对照组、间歇性跛行和严重肢体缺血患者骨骼肌中DNA甲基化组和转录组的差异。我们还通过比较间歇性跛行患者在血运重建手术前和术后6个月的DNA甲基化和基因表达变化来评估这些改变。结果：多组学方法识别了PAD骨骼肌中可能在甲基化水平上受到调控的缺氧相关基因。具体而言，结合与表达靶点分析显示，DNA甲基化组的表观遗传修饰可能有助于调节家族序列相似性20成员C和内皮PAS结构域蛋白1（也称为缺氧诱导因子-2α）的mRNA表达。此外，AP-1（激活蛋白-1）早期反应转录因子FOS和FOSB成为可能受血运重建手术影响的主要基因。结论：我们的发现识别了PAD骨骼肌中可能受DNA甲基化调控的新型缺氧相关基因。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAD如何影响骨骼肌DNA甲基化组，并鉴定可能受甲基化调控的缺氧相关基因？
- 核心机制
- DNA甲基化可能调控EPAS1和FAM20C的mRNA表达，其中EPAS1（HIF-2α）在CLI中显示内含子区域高甲基化。
- 主要证据
- RRBS和RNA-seq数据整合（BETA分析）显示EPAS1和FAM20C的甲基化与表达相关；独立队列验证显示EPAS1和FAM20C表达上调。
- 研究意义
- 首次在PAD骨骼肌中探索DNA甲基化组，揭示缺氧相关基因可能受甲基化调控，为PAD治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
评估PAD骨骼肌的基因表达变化
使用bulk RNA-seq和small RNA-seq检测骨骼肌转录组，比较IC vs CON、CLI vs CON的差异表达基因和microRNA，并进行GO和通路富集分析。
甲基化与转录组整合分析
鉴定可能受DNA甲基化调控的基因
使用BETA整合RRBS和RNA-seq数据，识别显著受甲基化调控的差异表达基因。
独立队列验证
验证关键基因EPAS1和FAM20C的表达差异
使用两个公开RNA-seq数据集（GSE120642和Ferrucci et al.）分析PAD和CON肌肉中EPAS1和FAM20C的表达水平。
血运重建前后分析
评估血运重建对骨骼肌DNA甲基化和转录组的影响
对IC患者血运重建前和术后6个月的骨骼肌样本进行RRBS和RNA-seq，分析DNA甲基化和基因表达的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
DNA甲基化检测
整合分析
验证分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | Quick-DNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | D3021 |
| DNA质量检测 | NanoDrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RRBS文库制备 | MspI限制性内切酶 | New England Biolabs | R0106S |
| DNA清洁与浓缩器-5 | Zymo Research | D4003 | |
| EZ DNA甲基化-闪电试剂盒 | Zymo Research | D5030 | |
| RNA提取 | Direct-zol RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R2060 |
| RNA质量检测 | RNA ScreenTape检测 | Agilent Technologies | -- |
| Agilent TapeStation 2200 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA-seq文库制备 | Zymo-Seq无核糖体总RNA文库制备试剂盒 | Zymo Research | R3000 |
| small RNA-seq文库制备 | TruSeq小RNA样本制备试剂盒 | Illumina Inc. | RS-200 |
| 文库质量检测 | 高灵敏度D1000检测 | Agilent Technologies | 5067 |
| 文库定量 | Qubit双链DNA高灵敏度检测 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 |
| KAPA文库定量试剂盒（Illumina平台） | Kapa Biosystems | KR0405 | |
| 测序 | Illumina NovaSeq X | Illumina Inc. | -- |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina Inc. | -- | |
| Illumina HiSeq 2500 | Illumina Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| DNA甲基化分析 | 样本量（每组10例）、性别比例（IC组90%男性，CON组40%男性，CLI组50%男性）、DMR定义（FDR≤0.05且甲基化差异≥0.2）、性别协变量调整 阅读提示：Methods中DNA Isolation, Library Construction, and Reduced Representation Bisulfite Sequencing；Results中DNA Methylome Profiling of Peripheral Artery Disease Skeletal Muscle |
| RNA-seq分析 | 样本量（每组10例）、性别协变量调整、DEG定义（FDR≤0.05，IC vs CON使用名义P值<0.05）、配对设计（血运重建前后） 阅读提示：Methods中RNA Isolation, Library Construction, and RNA-Seq；Results中Transcriptomic Profiling of Peripheral Artery Disease Skeletal Muscle |
| 整合分析（BETA） | CpG岛转换、BETA显著性阈值（全局调控潜能评分P≤0.05） 阅读提示：Methods中BETA Integration；Results中Integration of Methylomics and Transcriptomics Analyses in PAD Skeletal Muscle |
| 血运重建前后分析 | IC患者基线及术后6个月配对样本、DMR和DEG定义 阅读提示：Methods中Study Population；Results中Effect of Revascularization on the Skeletal Muscle DNA Methylome and Transcriptome |