鉴定MDA5内源性RNA配体
利用iCLIP确定MDA5在病毒感染时结合的RNA种类。
在EMCV感染的IRF3敲除THP1细胞和SARS-CoV-2感染的Calu-3细胞中进行内源性MDA5的iCLIP实验，包括双免疫沉淀、RNA交联、测序和数据分析。
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细胞RNA稳态的丧失促进病毒感染期间MDA5的激活
Loss of cellular RNA homeostasis contributes to MDA5 activation during virus infection
实验完整度
高使用iCLIP鉴定MDA5配体，结合RNA测序和功能验证（SRSF3过表达），涉及细胞模型（THP1、Calu-3）和两种病毒（EMCV、SARS-CoV-2），并包含机制验证。
主要模型
THP1细胞（IRF3敲除） Calu-3细胞 LIM1215细胞（SRSF3过表达）
重点核对
MDA5结合位点主要位于内含子，且靠近Alu元件 EMCV和SARS-CoV-2感染增加细胞质异常RNA SRSF3过表达减少异常RNA并抑制MDA5激活
摘要
MDA5是一种先天免疫RNA传感器，可感知多种病毒及其他病原体的感染。MDA5的RNA激动剂尚未明确。这里我们使用单核苷酸分辨率交联免疫沉淀（iCLIP）研究其配体。值得注意的是，在感染SARS-CoV-2或脑心肌炎病毒后，MDA5主要结合细胞RNA。许多结合位点位于内含子中，且靠近Alu元件和潜在碱基配对结构。同时，感染细胞中异常转录本和含内含子的未剪接转录本的细胞质水平增加，并显示出MDA5 iCLIP峰的富集。此外，过表达剪接因子SRSF3可减少异常转录并消除MDA5激活。综上，我们提出MDA5监测RNA加工保真度，并能通过感知剪接等转录后事件的扰动来检测感染。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 病毒感染时MDA5的RNA激动剂是什么？
- 核心机制
- 病毒感染破坏宿主RNA加工，导致异常RNA（如内含子RNA）在细胞质积累，MDA5感知这些异常RNA而被激活。
- 主要证据
- iCLIP显示MDA5主要结合宿主RNA；感染细胞中异常RNA增加且与MDA5结合位点相关；SRSF3过表达减少异常RNA并抑制MDA5激活。
- 研究意义
- 提出MDA5作为RNA加工保真度的守卫者，为理解MDA5在感染和自身炎症中的作用提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证宿主RNA对MDA5的激活
验证含有MDA5结合位点的宿主RNA是否能激活MDA5。
从基因组序列体外转录获得约500nt的RNA，退火形成dsRNA，转染至RIG-I敲除或RIG-I/MDA5双敲除的p125HEK报告细胞、Huh7细胞和MEF细胞，检测IFN应答。
分析病毒对RNA加工的影响
检查病毒感染是否导致异常RNA转录和加工。
提取感染细胞和IFNβ处理细胞的细胞质RNA，进行RNA测序，分析异常转录事件（内含子转录、下游转录）和内含子保留。
恢复RNA稳态验证MDA5激活
通过过表达剪接因子SRSF3恢复RNA稳态，检验MDA5激活是否被抑制。
在LIM1215细胞中稳定过表达SRSF3-GFP，感染EMCV或IAV，检测细胞活力、病毒复制、异常RNA水平及IFN应答。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Sigma Aldrich | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| MEM培养基 | Sigma Aldrich | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 基因敲除 | LTX转染试剂盒 | Life Technologies | -- |
| MDA5 iCLIP | 核糖核酸酶A | Affymetrix | 70194Y |
| RNAsin Plus RNA酶抑制剂 | Promega | N2611 | |
| Dynabeads磁珠 | Invitrogen | 14311D | |
| T4多核苷酸激酶 | New England Biolabs | M0201L | |
| Turbo DNA酶I | Life Technologies | AM2238 | |
| iCLIP 3'接头 | Trilink | O-30050-03 | |
| T4 RNA连接酶1高浓度 | New England Biolabs | M0437M | |
| 蛋白酶K | Roche | 03115844001 | |
| TGIRT逆转录酶 | InGex | CM0101-50 | |
| CircLigase II环化酶 | Cambio | CL9021K | |
| BamHI限制性内切酶 | New England Biolabs | -- | |
| Accuprime PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MiniElute PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| Qubit高灵敏度DNA定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Illumina | 07960093001 | |
| NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| NextSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| MDA5 iCLIP (SARS-CoV-2) | ProNex化学试剂 | Promega | NG2001 |
| 抗体 | J2抗dsRNA抗体 | Scicons | -- |
| SRSF3抗体 | Sigma | WH0006428M8 | |
| MAVS抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-17256 | |
| GFP抗体 | Thermo Fisher Scientific | A21311 | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白抗体 | GeneTex | GTX632604 | |
| MxA抗体 | Merck | MABF938 | |
| 免疫印迹 | NuPAGE LDS样品上样缓冲液 | Life Technologies | -- |
| 4-12% Bis-Tris凝胶 | Life Technologies | NP0322BOX | |
| MOPS电泳缓冲液 | Life Technologies | NP0001 | |
| 转膜缓冲液 | Life Technologies | NP0006 | |
| Western LightningPlus-ECL化学发光试剂 | PerkinElmer | -- | |
| iBright成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | Live/Dead可固定Aqua细胞染色剂 | Life Technologies | L34957 |
| Fc受体阻断剂 | eBioscience | -- | |
| CellFix固定液 | BD | 340181 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NovoCyte流式细胞仪 | ACEA Biosciences | -- | |
| 共聚焦显微镜 | 多聚赖氨酸 | Merck | -- |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | Invivogen | -- | |
| 鬼笔环肽AlexaFluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A22284 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂含DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Zeiss 780倒置共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| RT-qPCR | SuperScript III逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Oligo-dT引物 | Invitrogen | -- | |
| TaqMan实时PCR检测 | -- | -- | |
| TaqMan Fast Advanced预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantStudio 6 Flex实时PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IFNB1启动子荧光素酶实验 | ONE-Glo荧光素酶检测试剂 | Promega | E6120 |
| GloMax发光检测仪 | Promega | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
| 高分子量聚肌苷酸-聚胞苷酸 | Invivogen | tlrl-pic | |
| 细胞因子处理 | 干扰素α/β混合 | R&D Systems | -- |
| RNA提取 | RNeasy Plus微型试剂盒 | QIAGEN | 74136 |
| DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | 69504 | |
| 体外转录 | Herculase II PCR试剂盒 | Agilent | 600677 |
| MegaScript T7试剂盒 | Invitrogen | AM1334 | |
| RNeasy微型试剂盒 | QIAGEN | 74104 | |
| Tapestation自动化电泳系统 | Agilent | -- | |
| RNA提取 | 细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒 | Norgen | -- |
| RNA测序 | Tru-Seq链特异性总RNA测序方案 | Illumina | -- |
| NextSeq 2000 P3芯片 | Illumina | -- | |
| Dragen BCLConvert | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | Incucyte Cytotox近红外染料 | Sartorius | -- |
| Incucyte SX5活细胞成像系统 | Sartorius | -- | |
| 其他 | GraphPad Prism | -- | -- |
| FlowJo软件 | BD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒感染 | THP1细胞需用PMA处理，EMCV感染MOI=5，22小时；Calu-3细胞SARS-CoV-2感染MOI=0.1，48小时。 阅读提示：Methods: Cell culture and virus infection |
| MDA5 iCLIP | UV交联剂量150 mJ/cm²，RNase A稀释度1:10000，双免疫沉淀抗体验证。 阅读提示：Methods: MDA5 iCLIP |
| 体外转录RNA转染 | IVT-dsRNA浓度175 ng，Poly(I:C) 87.5 ng，Lipofectamine 2000用量0.7 μl。 阅读提示：Methods: Cell transfection of IVT-RNA |
| 细胞质RNA提取与测序 | THP1细胞EMCV感染MOI=2，20小时；Calu-3细胞SARS-CoV-2感染MOI=0.1，48小时；IFNβ处理100 U/ml，6小时。 阅读提示：Methods: Cytoplasmic RNA extraction and RNA sequencing |