空间转录组学图谱构建
绘制CD肠组织中细胞状态的空间分布和微环境特征
采用10x Xenium空间转录组学对16例CD患者的全层肠组织进行5,000-plex检测，使用CellCharter识别细胞微环境，并通过CellTypist进行细胞注释。
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克罗恩病中基质细胞状态的表观遗传调控构成病理性组织微环境
Epigenetic modulation of stromal cell states underpins pathological tissue niches in Crohn's disease
实验完整度
高包含空间转录组、scATAC-seq、scRNA-seq、体外细胞模型、siRNA敲低、表观遗传抑制剂处理、肠道芯片等多层级证据，并进行了功能验证。
主要模型
Ccd18-Co人肠道基质细胞系 人CD全层肠组织（Xenium空间转录组学） 患者来源的原代成纤维细胞 人肠道芯片模型
重点核对
细胞因子组合（IL-1β、IL-17A、OSM、TNF）的浓度：IL-1β为0.01 ng/ml，其余为10 ng/ml，处理时间24小时 体外IF诱导方案：三次细胞因子脉冲（每次72小时）后恢复96小时，最后一次后至少休息2周 表观遗传抑制剂处理：贝利司他等浓度（2,700 nM，A-485为540 nM），处理5天，DMSO 1:5,000稀释作为对照 siRNA敲低实验：使用ON-TARGETplus SMARTpool siRNA敲低PRDM1、RELB、ETV4，浓度为16.5 nM 肠道芯片实验：使用Dynamic42生物芯片，以100 ng/ml LPS预处理48小时，随后加入成纤维细胞上清液24小时，再加入1×10^6 PMNs
摘要
在活动性克罗恩病（CD）中，基质细胞状态发生改变，但其起源和表型稳定性尚不清楚。利用单细胞空间转录组学、RNA测序和ATAC测序，我们绘制了约2,500,000个细胞中18种不同的基质细胞状态，并确定了它们在人类全层CD肠道中的细胞和细胞因子信号环境。炎症性成纤维细胞（IF）存在于富含免疫细胞的黏膜溃疡中，并通过组合细胞因子暴露诱导，抑制黏膜下普遍成纤维细胞程序。IF状态通过转录因子（TF）GLI3、TWIST1、ETV4、PRDM1和RELB的活性得以稳定，并且不会自发逆转；然而，组蛋白去乙酰化酶抑制可破坏IF状态的稳定性，阻止IF分泌组诱导的上皮迁移和中性粒细胞活化。IF的开放染色质构型与纤维化收缩性基质的构型不同，后者填充于相邻的免疫耗竭的黏膜下纤维化微环境中。这些发现表明，病理性组织微环境中的微环境塑造了基质细胞状态的开放染色质构型，而这些状态可通过表观遗传修饰剂进行调节。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 克罗恩病中炎症性成纤维细胞（IF）和收缩性基质（CS）状态如何起源、如何被组织微环境稳定，以及是否可以通过表观遗传调控改变？
- 核心机制
- 组合细胞因子信号（IL-1β、IL-17A、OSM、TNF）通过重塑开放染色质构型并激活转录因子GLI3、TWIST1、ETV4、PRDM1和RELB，诱导并稳定IF状态；组蛋白去乙酰化酶抑制（如贝利司他）可下调这些TF的染色质可及性，破坏IF状态。
- 主要证据
- 通过Xenium空间转录组学识别出IF和CS在不同微环境中的分布；通过scATAC-seq显示IF和CS具有不同的开放染色质特征；体外细胞因子脉冲实验生成稳定的IF状态；siRNA敲低实验验证PRDM1、ETV4、RELB对IF标志物的调控；贝利司他处理后IF标志物下调，并抑制IF分泌组诱导的中性粒细胞迁移和活化。
- 研究意义
- 研究提出了病理性组织微环境通过塑造基质细胞开放染色质构型来稳定特定细胞状态的概念，并表明表观遗传修饰剂（如HDAC抑制剂）可能成为治疗难治性CD的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA和ATAC测序
分析CD组织中基质细胞的转录组和开放染色质特征
从CD患者组织中分离基质细胞（FACS排序PDPN+和/或THY1+），进行10x Chromium scRNA-seq和scATAC-seq。
体外IF模型生成
验证组合细胞因子能否稳定诱导IF状态
用IL-1β、IL-17A、OSM和TNF混合处理Ccd18-Co细胞，三次脉冲后恢复至少2周，检测IF标志物表达和开放染色质谱。
转录因子验证
验证预测的IF相关转录因子对IF表型的调控作用
使用siRNA敲低PRDM1、RELB和ETV4，测量CXCL5、CXCL8和MMP1表达。
表观遗传修饰剂处理
测试表观遗传修饰剂是否能破坏IF状态
对已极化的IF细胞用各种表观遗传抑制剂处理5天，包括贝利司他、A-485、GSK-J4、他泽美司他、iBRD9和JQ-1，处理2周后评估IF标志物和染色质变化。
肠道芯片实验
评估贝利司他对IF分泌组介导的屏障功能影响
利用肠道芯片系统，将IF上清液（未经处理或经贝利司他处理）作用于血管侧，加入中性粒细胞后检测上皮屏障标志物、NF-κB激活和中性粒细胞迁移。
中性粒细胞激活实验
评估IF分泌组对中性粒细胞激活的影响
将健康供体来源的人类中性粒细胞与成纤维细胞上清液共孵育4小时，通过流式细胞术检测CD16、CXCR1和CXCR2表面表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间转录组学 | Xenium Prime 5K人类全组织和通路面板 | 10x Genomics | -- |
| Xenium人类多组织和癌症面板 | 10x Genomics | -- | |
| 细胞培养 | Ccd-18Co | ATCC | CRL-1459 |
| MEMα培养基 | Sigma-Aldrich | 12571063 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | A5209501 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| 细胞因子刺激 | 重组人IL-1β | Peprotech | -- |
| 重组人IL-17A | Peprotech | -- | |
| 重组人OSM | Peprotech | -- | |
| 重组人TNF | Peprotech | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | QIAGEN | 74104 |
| Quick-RNA 96试剂盒 | Zymo Research | R-1052 | |
| ATAC-seq | Nextera Tn5转座酶 | Illumina | FC-121-1030 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28004 | |
| NEBNext高保真2x PCR预混液 | New England Biolabs | M0541 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S7563 | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Roche | 07960166001 | |
| Ampure XP磁珠 | Beckman | A63880 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | Abcam | ab228554 |
| 中性粒细胞分离 | MACSxpress全血中性粒细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-434 |
| 流式分析 | 固定化活性染料eFluor 780 | eBioscience | 1:1000稀释 |
| DAPI | Invitrogen | H3570 | |
| FITC抗人EPCAM抗体 | BioLegend | 324204 | |
| BV510抗人CD90抗体 | BioLegend | 328126 | |
| AF700抗人CD45抗体 | BioLegend | 304024 | |
| APC抗人PDPN抗体 | eBioscience | 17-9381-42 | |
| BV605抗人CD31抗体 | BioLegend | 303122 | |
| CD16抗体 | BioLegend | 360732 | |
| CXCR2抗体 | BioLegend | 320706 | |
| CXCR1抗体 | BioLegend | 320605 | |
| CD66b抗体 | BioLegend | 305122 | |
| CD45抗体 | BioLegend | 304024 | |
| CD3抗体 | BioLegend | 317318 | |
| CD14抗体 | BD Biosciences | 565283 | |
| 固定缓冲液 | BioLegend | 420801 | |
| ELISA | 人CXCL5 ELISA Duo Set | R&D Systems | DY-254 |
| 人CXCL5 Quantikine ELISA试剂盒 | R&D Systems | DX000 | |
| Luminex | 定制Luminex试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 中和抗体 | 抗OSM中和抗体 | R&D Systems | MAB295 |
| 抗IL-1β中和抗体 | R&D Systems | MAB201 | |
| 抗TNF中和抗体 | R&D Systems | MAB610 | |
| 抗IL-17A中和抗体 | R&D Systems | MAB317 | |
| siRNA转染 | ON-TARGETplus SMARTpool PRDM1 siRNA | Horizon Discovery | L-009322-00 |
| ON-TARGETplus SMARTpool RELB siRNA | Horizon Discovery | L-004767-00 | |
| ON-TARGETplus SMARTpool ETV4 siRNA | Horizon Discovery | L-004207-00 | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| qPCR | TaqMan基因表达测定试剂盒（CXCL5） | Thermo Fisher Scientific | Hs01099660_g1 |
| TaqMan基因表达测定试剂盒（CXCL8） | Thermo Fisher Scientific | Hs00174103_m1 | |
| TaqMan基因表达测定试剂盒（MMP1） | Thermo Fisher Scientific | Hs00899658_m1 | |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| Precision FAST预混液 | Primer Design | -- | |
| 肠道芯片 | 生物芯片BC002 | Dynamic42 | BC002 |
| 大肠杆菌脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫荧光 | 小鼠抗CD66b抗体 | BioLegend | 305102 |
| 山羊抗ZO-1抗体 | Invitrogen | PA5-19090 | |
| 兔抗E-cadherin抗体 | Cell Signaling | 3195S | |
| 组织消化 | 胶原酶A | Sigma-Aldrich | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | -- | |
| 牛血清白蛋白 | 文中未明确说明 | -- | |
| 人抗Fc阻断剂 | Miltenyi | -- | |
| Histopaque密度梯度液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PolymorphPrep密度梯度液 | Progen | -- | |
| 流式细胞分选 | BD Aria III流式细胞分选仪 | BD | -- |
| 测序 | NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- |
| NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| 显微成像 | NanoZoomer数字玻片扫描仪 | Hamamatsu | -- |
| ZEISS Axiovert 200M显微镜 | ZEISS | -- | |
| ZEISS Apotome 2 | ZEISS | -- | |
| 流式细胞分析 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| Luminex检测 | Luminex MAGPIX分析仪 | Luminex | -- |
| 细胞因子处理 | 重组人IL-6 | Peprotech | -- |
| 重组人IL-22 | Peprotech | -- | |
| 重组人IFN-α | Peprotech | -- | |
| 重组人IFN-γ | Peprotech | -- | |
| 重组人TGF-β1 | Peprotech | -- | |
| 表观遗传抑制剂 | 贝利司他 | 文中未明确说明 | -- |
| A-485 | 文中未明确说明 | -- | |
| GSK-J4 | 文中未明确说明 | -- | |
| 他泽美司他 | 文中未明确说明 | -- | |
| iBRD9 | 文中未明确说明 | -- | |
| JQ-1 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 空间转录组学 | Xenium芯片类型、组织制备（FFPE切片厚度）、细胞分割参数（边界染色、核扩张）、n=16例CD组织样本（每例取1个切片） 阅读提示：Methods: 10x Xenium spatial transcriptomics; Figure 1 legend |
| 细胞因子刺激实验 | 细胞系Ccd18-Co,细胞接种密度（25,000细胞/200μl），血清饥饿时间（72小时），细胞因子浓度（IL-1β 0.01 ng/ml，其余10 ng/ml），刺激时间（24小时），重复数（n=4） 阅读提示：Methods: Stromal cytokine response atlas generation; Figure 3a legend |
| 体外IF诱导 | 细胞因子组合（IL-1β 0.01 ng/ml, IL-17A 10 ng/ml, OSM 10 ng/ml, TNF 10 ng/ml），脉冲次数（3次），脉冲持续时间（72小时）和恢复期（96小时），最后一次后休息时间（≥2周） 阅读提示：Methods: In vitro inflammatory fibroblast model; Figure 4e legend |
| siRNA敲低 | siRNA类型（ON-TARGETplus SMARTpool），靶基因（PRDM1、RELB、ETV4），siRNA浓度（16.5 nM），转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX），转染时间（24小时），检测基因（CXCL5、CXCL8、MMP1） 阅读提示：Methods: RNA interference; Figure 4l,m legends |
| 表观遗传抑制剂处理 | 抑制剂种类和浓度（贝利司他等2700 nM，A-485 540 nM），处理时间（5天），随后恢复期（≥2周），DMSO浓度（1:5000）作为对照 阅读提示：Methods: Epigenetic modulator perturbations; Figure 6a legend |
| 肠道芯片实验 | 芯片类型（Dynamic42 BC002），细胞系（HUVECs、PBMC来源巨噬细胞、C2BBe1），LPS浓度（100 ng/ml，48小时），上清液处理时间（24小时），PMN数量（1×10^6），PMN循环时间（4小时） 阅读提示：Methods: Gut-on-a-chip experiments; Figure 6h legend |